姜海燕，狄佳麟，叢 林，閆 偉，白娜娜，張 旭，白 慧

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指那些全部或近整個生命周期生活在宿主植物的各類細胞及細胞間隙、組織、器官內(nèi)部，卻不會使寄主表現(xiàn)出不良癥狀的真菌類群[1-2]。大量研究表明：內(nèi)生真菌可以通過競爭生存空間和營養(yǎng)元素[3]、溶菌作用[4]、影響病原真菌菌絲生長及孢子發(fā)育方式[5]等抑制病原菌的生長，同時刺激根毛形成和根莖生長，提高植物感病時的光合作用及酶活性[6-7]，提高植物抗病能力。沙地云杉Picea mongolica是松科Pinaceae云杉屬Picea常綠針葉喬木，是內(nèi)蒙古特有樹種，沙質(zhì)土地上的活化石[8]。由于近年來大面積的立枯病等病蟲害的頻繁發(fā)生[9]，沙地云杉正面臨著可能滅絕的危險。目前，噴施化學(xué)農(nóng)藥是防治嚴重林木病害的主要措施，但農(nóng)藥利用率低下，極不適宜應(yīng)用于大面積的森林，急需開發(fā)天然生物資源代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥試劑。本研究選取前期篩選的4株具有強拮抗作用的沙地云杉內(nèi)生真菌為試驗材料，以沙地云杉立枯病病原真菌Fusariumsp.為靶標菌，采用體外對峙和盆栽試驗，探究內(nèi)生拮抗菌的拮抗活性和對沙地云杉的抗病作用，旨在為利用生物資源、開發(fā)生防菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試沙地云杉內(nèi)生拮抗菌 4株沙地云杉內(nèi)生拮抗菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林病理實驗室提供[10]，分別是互隔鏈格孢菌Alternaria alternata(SDYS36)、三線鐮刀菌Fusarium tricinctum(SDYS63)、產(chǎn)黃青霉菌Penicillium chrysogenum(SDYS95)、聚多曲霉菌Aspergillus sydowii(SDYS180)。

1.1.2 供試林木病原真菌 沙地云杉立枯病病原菌Fusariumsp.由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林病理實驗室提供。

1.1.3 供試沙地云杉種子 沙地云杉種子由赤峰市白音敖包自然保護區(qū)提供。除雜后挑選種實飽滿、色澤正常的健康種子，低溫保存?zhèn)溆?。千粒重?.011 4 g。

1.1.4 主要培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 在超凈工作臺內(nèi)將沙地云杉內(nèi)生拮抗菌和沙地云杉立枯病病原菌供試菌株切成0.2 cm×0.2 cm的菌塊，接種于已滅菌的PDA平板進行純培養(yǎng)；無菌條件下，用5 mm打孔器在培養(yǎng)7 d的供試菌株平板邊緣打成圓形菌餅，接種于加有100 mL滅菌后的PD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，震蕩培養(yǎng) 5～7 d (28 ℃，180 r·min-1)，得到發(fā)酵菌液備用；取上述發(fā)酵液離心 (8 000 r·min-1，4 ℃) 2 min 后留上清液，在超凈工作臺通過0.22 μm濾膜，即為無菌發(fā)酵液。

1.2.2 內(nèi)生拮抗菌發(fā)酵液對沙地云杉立枯病病原菌的拮抗活性測定 采用生長速率法[11]，以立枯病病原菌為靶標菌，測試沙地云杉內(nèi)生拮抗菌株發(fā)酵液拮抗活性。無菌條件下，加定量無菌發(fā)酵液于PDA培養(yǎng)基(40～50 ℃)混勻，制成平板(Ф=7.5 cm)，冷凝后在中心位置接入靶標菌，每組均設(shè)5個重復(fù)，以加入相同比例無菌水的平板上靶標菌的生長作為對照(ck)，25 ℃倒置培養(yǎng)。待對照中靶標菌長滿平板時，測量靶標菌的菌落直徑，計算相對抑菌率。相對抑菌率RI=(Rc-Rp)/Rc×100%。Rc為對照靶標病原菌的菌落直徑，Rp為對峙實驗中靶標病原菌的菌落直徑。

1.2.3 內(nèi)生拮抗菌菌體對沙地云杉立枯病病原菌的拮抗活性測定 采用皿內(nèi)對峙法[12]，以立枯病病原菌為靶標菌，測試沙地云杉內(nèi)生拮抗菌株拮抗活性。無菌條件下，將內(nèi)生拮抗菌株和靶標菌分別接種在PDA平板(Ф=7.5 cm)上，各距中心位置2.5 cm，以單獨培養(yǎng)靶標菌為對照(ck)，均設(shè)5個重復(fù)，25 ℃倒置培養(yǎng)。記錄對峙培養(yǎng)中靶標菌菌落的相對生長距離，計算相對抑菌率。

1.2.4 內(nèi)生拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對沙地云杉立枯病病原菌的拮抗活性測定 采用對扣抑制法[13]，以立枯病病原菌為靶標菌，測試沙地云杉內(nèi)生拮抗菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的拮抗活性。無菌條件下，將內(nèi)生拮抗菌株和靶標菌分別接種在2個PDA平板(Ф=9.0 cm)中心，撤去皿蓋，靶標菌在上、拮抗菌在下對扣放置，以單獨培養(yǎng)靶標菌為對照(ck)，均設(shè)5個重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)。記錄對峙培養(yǎng)中靶標菌菌落的相對生長距離，計算相對抑菌率。

1.2.5 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對盆栽沙地云杉立枯病拮抗試驗 參照袁宗勝等[14]、鄧勛等[15]的方法及《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》[16]，通過灌根處理將內(nèi)生拮抗菌株及發(fā)酵菌液接種在外觀大小相似的1年生沙地云杉健壯幼苗上，并設(shè)置單獨澆灌PD液體培養(yǎng)基(PD)和清水(ck)等2組對照，每種處理設(shè)置苗200株，共有苗1 200株，待土壤表面干燥后接種沙地云杉立枯病原菌。發(fā)病后，比較病苗生長30和45 d時的形態(tài)(株高生長量、地徑生長量、根長生長量)和葉片組織的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、保護酶活性的變化，分析內(nèi)生拮抗菌株對沙地云杉染病幼苗抵抗立枯病的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 4株沙地云杉內(nèi)生拮抗菌株的體外拮抗活性

2.1.1 內(nèi)生拮抗菌株發(fā)酵液對沙地云杉立枯病病原菌的拮抗活性 4株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液對病原菌均有顯著的抑制作用，抑菌率為51.64%～78.67%。4株內(nèi)生真菌對沙地云杉立枯病病原菌的抑菌率均在51.64%以上。SDYS180發(fā)酵液的抑菌率最高，達到78.67%。與另外3株內(nèi)生真菌發(fā)酵液間差異顯著(P＜0.05) (表1)。4株真菌發(fā)酵液的抑菌率從大到小依次為SDYS180、SDYS36、SDYS63、SDYS95。

表1 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌的拮抗作用Table 1 Antagonistic effects of endophytic fungi in P. mongolica on Fusarium sp.

2.1.2 內(nèi)生拮抗菌株對沙地云杉立枯病病原菌的拮抗活性 4株沙地云杉內(nèi)生真菌菌體本身對沙地云杉立枯病病原真菌均有顯著的抑制作用，抑菌率均大于51.96%。抑菌率從大到小依次為SDYS95、SDYS180、SDYS36、SDYS63。其中，SDYS95的抑制效果最強，抑菌率達到69.64%，與另外3株內(nèi)生真菌差異顯著 (P＜0.05) (表1)。

2.1.3 內(nèi)生拮抗菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對沙地云杉立枯病病原菌的拮抗活性 4株沙地云杉內(nèi)生真菌菌株的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對沙地云杉立枯病病原真菌的生長有一定的拮抗作用，但抑制率較低，抑菌率從大到小依次為SDYS63、SDYS36、SDYS180、SDYS95(表1)。其中，拮抗效果最強的SDYS63，抑菌率僅達到16.94%，與SDYS95內(nèi)生真菌差異顯著(P＜0.05)；拮抗效果最弱的是SDYS95，抑菌率僅有13.06%。

2.2 4株沙地云杉內(nèi)生拮抗菌株對盆栽沙地云杉立枯病的拮抗作用

2.2.1 內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗形態(tài)指標的影響 發(fā)病30 d時，各處理染病幼苗株高從高到低依次表現(xiàn)為SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，試驗組株高較ck高0.91%～16.01%，PD生長勢衰弱，可見菌絲著生。發(fā)病45 d時，各處理染病幼苗株高從高到低依次為SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，試驗組苗木的株高較ck高出1.42%～18.31%，ck葉片退綠枯黃或死亡。通過PD與ck的對比，說明病原菌抑制病苗株高生長；試驗組相對ck株高顯著增加，說明內(nèi)生真菌能有效抑制病原菌。2次取樣SDYS180的病苗株高生長均最高，與ck和PD具有顯著差異(P＜0.05)。菌株SDYS180及其代謝產(chǎn)物在苗木株高生長上抗病效果最佳(圖1)。

圖1 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗株高的影響Figure 1 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the plant height of infected seedlings

30 d時，各處理染病幼苗地徑從大到小依次為SDYS36、SDYS63、SDYS180、SDYS95、ck、PD，試驗組地徑較ck高5.90%～19.04%，PD較ck低10.22%。45 d時，各處理地徑從大到小依次呈現(xiàn)為SDYS180、SDYS36、SDYS95、SDYS63、ck、PD，帶菌植株地徑較ck高出14.59%～32.64%，PD較ck低13.96%。通過PD與ck的對比，說明病原菌抑制植株地徑的增長。試驗組相對ck顯著增加，說明內(nèi)生真菌有效抑制發(fā)??；2次取樣SDYS180的增加幅度最大，與ck、PD差異性均達顯著水平(P＜0.05)，說明菌株SDYS180及其代謝產(chǎn)物在苗木地徑生長上抗病效果最佳(圖2)。

圖2 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗地徑的影響Figure 2 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the ground diameter of infected seedlings

30d時，各處理染病幼苗根長從大到小依次為SDYS63、SDYS95、SDYS180、SDYS36、ck、PD(圖3)，試驗組根長較ck高0.42%～11.91%，PD較ck低10.22%。45d時，各處理染病幼苗根長從大到小依次為SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，帶菌植株較ck高10.17%～16.56%，PD較ck低13.96%。通過PD與ck的對比，說明病原菌抑制植株根長生長。試驗組相對ck顯著增加，說明內(nèi)生真菌有效抑制發(fā)??；2次取樣SDYS180的根長增加幅度最大，45 d取樣與ck、PD差異性均顯著(P＜0.05)，說明菌株SDYS180及其代謝產(chǎn)物在苗木根長生長上抗病效果最佳。

圖3 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗根長的影響Figure 3 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the root length of infected seedlings

2.2.2 內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗滲透調(diào)節(jié) (可溶性蛋白質(zhì))的影響 30d 時，各處理染病幼苗中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)從高到低依次為SDYS180、SDYS95、SDYS63、ck、SDYS36、PD，SDYS180和SDYS95與ck、PD間差異性顯著(P＜0.05)，高出ck 2.68%和2.10%，PD較ck低2.43%(圖4)。45 d時各處理染病幼苗中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)從高到低依次為SDYS95、SDYS36、SDYS63、SDYS180、ck、PD，試驗組較ck高5.48%～13.41%，PD較ck低8.20%。2次取樣PD和ck葉片組織中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)大幅下降，病原菌破壞植物細胞結(jié)構(gòu)，影響滲透調(diào)節(jié)作用。SDYS180、SDYS95、SDYS63相對ck可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)顯著增加，說明3株對應(yīng)內(nèi)生真菌有效抑制病原菌對滲透調(diào)節(jié)的破壞。其中SDYS95的增加幅度最大，說明菌株SDYS95及其代謝產(chǎn)物在苗木上抗病效果最佳，促進植物組織中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的提高。

圖4 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗可溶性蛋白質(zhì)的影響Figure 4 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the SP content of infected seedlings

2.2.3 內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響 丙二醛(MDA)是由于植物膜脂過氧化作用的重要產(chǎn)物。丙二醛質(zhì)量摩爾濃度越高，說明植物細胞膜受損越嚴重。30 d時，各處理染病幼苗中丙二醛質(zhì)量摩爾濃度從大到小依次為PD、SDYS63、ck、SDYS36、SDYS180、SDYS95，SDYS95和SDYS180較ck降低了24.46%和21.10%；SDYS36降低不明顯，和ck僅差0.05%；SDYS63較ck高0.08%，效果不明顯；PD較ck高3.70%。45 d時，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度從大到小依次為PD、ck、SDYS95、SDYS36、SDYS180、SDYS63；試驗組和對照組比較，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度下降，說明內(nèi)生真菌抑制病原菌的傷害。其中菌株SDYS63在30 d樣品中高于ck，但在45 d樣本中丙二醛質(zhì)量摩爾濃度最低，說明SDYS63增強苗木抗病性，有效減少丙二醛質(zhì)量摩爾濃度，但拮抗效果不穩(wěn)定；在2次樣品中SDYS180和SDYS95的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度均低于ck，但SDYS180在45 d較SDYS95低10.19%，說明菌株SDYS180拮抗效果良好，而SDYS95作用效果最佳(圖5)。

圖5 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗 MDA 的影響Figure 5 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on MDA content of infected seedlings

2.2.4 內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗保護酶[過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)]活性的影響 30 d 時，各處理染病幼苗 POD 活性從高到低依次為 SDYS95、SDYS180 和SDYS36、SDYS63、PD、ck，其中PD較ck高63.24%，試驗組較ck高141.18%～250.00%；45 d時，各處理染病幼苗POD活性從高到低依次為SDYS95、SDYS63、SDYS180、SDYS36、PD、ck，其中PD較ck高48.37%，試驗組較ck高141.13%～224.46%(圖6)。通過PD和ck的比較，說明病原菌對幼苗POD影響不大，反而可能刺激POD活性。在拮抗過程中，在一定程度上被內(nèi)生真菌抑制。在2次樣本中，SDYS95的POD活性均最高，說明菌株SDYS95對提高幼苗抗病性最佳。

圖6 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗 POD 活性的影響Figure 6 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on POD activity of infected seedlings

30d時，各處理染病幼苗SOD活性從高到低依次為SDYS180、SDYS36、ck、SDYS95、SDYS95、PD，其中PD較ck低12.01%，SDYS180較其他處理表現(xiàn)出顯著差異(P＜0.05)，較ck高3.57%；45 d時，各處理染病幼苗SOD活性從高到低依次為SDYS63、SDYS36、SDYS95、SDYS180、ck、PD，其中PD較ck低37.56%，試驗組較ck高10.32%～57.36%(圖7)。通過PD和ck的比較，說明病原菌對幼苗SOD活性具有抑制作用。在2次樣本中，SDYS95的SOD活性均高于ck，說明菌株SDYS95及其代謝產(chǎn)物穩(wěn)定提高幼苗抗病性；SDYS63在30 d時抑制效果稍弱，但在45 d時抑制效果大幅增加，表明菌種SDYS63的代謝產(chǎn)物的拮抗效果最佳，同時促進SOD的活性增加。

圖7 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗 SOD 活性的影響Figure 7 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on SOD activity of infected seedlings

30 d時，各處理染病幼苗CAT活性從高到低依次為SDYS95、SDYS180、SDYS63、SDYS36、ck、PD，其中PD較ck低58.71%，試驗組較ck高3.87%～10.322%；45 d時，各處理染病幼苗CAT活性從高到低依次為SDYS36、SDYS180、SDYS63、SDYS95、ck、PD，其中PD較ck低60.66%，試驗組較ck高9.02%～43.44%(圖8)。通過PD和ck的比較，說明病原菌致病嚴重，對幼苗CAT活性具有抑制作用，在拮抗過程中，被內(nèi)生真菌抑制。在30 d樣本中，SDYS95的CAT活性最高，說明菌株SDYS95抗病效果良好，可提高幼苗抗病性；SDYS36在30 d時抑制效果稍低，但在45 d時抑制效果最佳，表明菌種SDYS36的代謝產(chǎn)物的拮抗效果良好，同時促進CAT活性增加。

圖8 沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對染病幼苗 CAT 活性的影響Figure 8 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on CAT activity of infected seedlings

3 討論

3.1 4株沙地云杉內(nèi)生拮抗菌株體外拮抗活性

內(nèi)生真菌作為一類新型待開發(fā)的微生物資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，開展最廣泛的研究領(lǐng)域就是內(nèi)生真菌的拮抗作用[17]。大量研究表明：內(nèi)生真菌對多種病原真菌具有很強的拮抗作用和廣譜性，通常表現(xiàn)在對生存空間和營養(yǎng)資源的競爭，并產(chǎn)生拮抗活性物質(zhì)抑制病原菌的生長[18]。本研究結(jié)果表明：4種沙地云杉內(nèi)生真菌經(jīng)體外培養(yǎng)后，其菌體本身及其代謝產(chǎn)物對植物病原真菌均表現(xiàn)出較強的拮抗活性。但這種拮抗作用存在一定的選擇性，可能由不同原因造成。如青霉Penicillium和曲霉屬Aspergillus真菌具有更快的擴展速度，在占據(jù)生存空間上具有很大的優(yōu)勢；雖然鐮刀菌Fusarium本身生長受到限制，但是可以通過產(chǎn)生具有拮抗活性的代謝產(chǎn)物，抑制病原真菌的生長。樊苗苗等[19]對樟葉越桔Vaccinium dunalianum葉中產(chǎn)黃青霉P. chrysogenum、曲霉、鏈格孢菌Alternaria、鐮刀菌等內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的拮抗活性進行研究，其結(jié)果與本研究一致。這些菌株及其代謝產(chǎn)物對病原真菌具有很好的拮抗活性。

3.2 4株沙地云杉內(nèi)生拮抗菌株對盆栽沙地云杉立枯病的拮抗作用

林木病原真菌可以破壞植物細胞壁，產(chǎn)生有毒物質(zhì)抑制寄主生長。植物內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物可以有效抑制植物病原菌在寄主植物中的萌發(fā)和生長，提高植物感病后的保護酶活性，從而有效提高植物的抗病能力[20]。本研究中，接種沙地云杉內(nèi)生真菌的感病植株生長幅度均高于對照，說明內(nèi)生真菌可以有效抑制沙地云杉染病植株上的病原菌，提高植株抗病能力，促進植物組織快速生長。此結(jié)果與鄧勛等[15]的木霉菌Trichoderma防治松苗立枯病的研究結(jié)果一致。

接種沙地云杉內(nèi)生真菌的感病植株丙二醛質(zhì)量摩爾濃度顯著低于對照組。丙二醛是一種由于質(zhì)膜過氧化作用而產(chǎn)生的錯誤的代謝產(chǎn)物，其含量越低，表示細胞膜通透性越低，即受損程度越弱。本研究結(jié)果表明：沙地云杉內(nèi)生真菌可以有效降低組織中丙二醛質(zhì)量摩爾濃度，有效保護細胞膜。本研究結(jié)果與張晶晶等[21]的研究結(jié)果一致。

接種沙地云杉內(nèi)生真菌的感病植株中的過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性比對照表現(xiàn)出不同程度提升。3種酶是植物細胞膜保護酶，起到清除活性氧的重要作用。本研究結(jié)果表明：內(nèi)生真菌可以有效激發(fā)沙地云杉抗氧化酶(保護酶)的活性。余承忠等[22]研究認為：病原菌致病性與內(nèi)生真菌提高寄主抗病能力顯著相關(guān)。這與本研究結(jié)果一致。

可溶性蛋白質(zhì)既是重要的營養(yǎng)物質(zhì)，更是關(guān)鍵的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本次研究結(jié)果表明：沙地云杉內(nèi)生真菌可以增加可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，調(diào)節(jié)組織細胞滲透調(diào)節(jié)作用。此結(jié)果與MA等[23]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

以沙地云杉立枯病病原真菌為靶標菌，4株沙地云杉內(nèi)生拮抗菌的發(fā)酵液均表現(xiàn)出良好的拮抗活性，菌株SDYS180發(fā)酵液的拮抗活性最高，SDYS95的菌株對峙拮抗活性最高，SDYS63的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的拮抗活性最高。

4株沙地云杉內(nèi)生拮抗菌對盆栽沙地云杉立枯病均表現(xiàn)出不同程度的拮抗活性。從病苗形態(tài)指標來看，SDYS180對盆栽沙地云杉立枯病的拮抗活性最高；從生理指標來看，拮抗活性最高的是SDYS95。