杜宇婷，王宏亮，趙三虎，王桂林

(忻州師范學(xué)院 化學(xué)系，山西 忻州 034000)

0 引言

次氯酸(HClO)，過氧化氫(H2O2)，羥基自由基(HO·)和超氧陰離子自由基被稱為活性氧(ROS)，它們能夠引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，與許多生理和病理過程相關(guān)[1-4]。其中，HClO吸引了很多人的關(guān)注，是因為它顯示出關(guān)鍵的抗菌特性[5]，以及它在生物、化學(xué)、環(huán)境及人體免疫防御系統(tǒng)中起著重要作用[6-7]。在生物體內(nèi)，內(nèi)源性的HClO是由過氧化氫和氯離子在髓過氧化物酶(MPO)的催化作用下產(chǎn)生[8]，HClO的產(chǎn)生在生物體內(nèi)是一把雙刃劍。好的一方面，次氯酸能夠保護(hù)生物體通過殺死入侵免疫系統(tǒng)中的病原體和細(xì)菌[9]。但是，另一方面，越來越多的證據(jù)表明，過量的HClO可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物分子被氧化，從而導(dǎo)致組織損傷、炎癥以及一系列疾病，比如炎癥甚至癌癥[10-13]。溶酶體pH值是維持溶酶體正常消化功能的參數(shù)，不同原因?qū)е碌娜苊阁wpH值改變可能會影響溶酶體蛋白酶的多種生理過程，進(jìn)而影響細(xì)胞正常功能。因此，基于以上原因，發(fā)展一種高選擇性和高靈敏性，用于溶酶體中次氯酸檢測方法具有重要意義。

在過去的幾十年里，傳統(tǒng)的HClO檢測手段比如化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)分析、比色法和質(zhì)譜法等[14-15]，但是其存在耗時長、操作繁瑣、檢測限低等局限性。由于HClO在人體生理中發(fā)揮著重要作用，因此需要設(shè)計新的方法來精確的測定體內(nèi)次氯酸根的含量。與這些傳統(tǒng)的分析方法相比，熒光檢測技術(shù)因其易于操作、響應(yīng)快速和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中[16-17]。近幾年報道有關(guān)次氯酸的反應(yīng)型熒光探針[18-19]，主要是基于次氯酸的強(qiáng)氧化性，比如對席夫堿、不飽和碳碳雙鍵、硫化物、硫縮酮和對甲氧基苯酚的氧化等[20-24]。

2008年，陳課題組報道了利用次氯酸的氧化性，將二苯甲酰肼氧化成羅丹明的二苯甲酰二亞胺[25]。2014年，Goswami 等發(fā)現(xiàn)了羅丹明類似物可以用于次氯酸的比率型檢測[26]。2015年，Lee 等報道了一個基于羅丹明和丹磺基部分被次氯酸氧化的熒光探針[27]。2020年，詹和他的同事發(fā)現(xiàn)了一個羅丹明螺旋環(huán)的一個次氯酸的檢測方法[28]。次氯酸對氟硼類衍生物的氧化也可以用于它的檢測[29-30]。

眾所周知，次氯酸可以把“C=C”和“C=N”氧化斷鍵[16,31]。因此，本文設(shè)計并合成了一種以3-(溴甲基)苯甲醛為原料，嗎啉作為溶酶體的靶向基團(tuán)，分兩步合成了一種檢測溶酶體中次氯酸的熒光探針BMOA(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)探針BMOA 對次氯酸檢測時具有超快的反應(yīng)時間(150 s)，高的靈敏度和選擇性。探針對次氯酸的最低檢出限僅為4.13 nmol/L和的特點(diǎn)。因此，本研究為次氯酸的檢測提供了一種簡單且有效的分析方法。高分辨質(zhì)譜機(jī)理驗證表明，熒光探針BMOA的“C=N”被次氯酸氧化而發(fā)生斷裂，釋放出MOB，從而使得熒光發(fā)生淬滅。

圖1 探針BMOA 對次氯酸的識別機(jī)理

1 實(shí)驗部分

1.1 試劑與儀器

3-(溴甲基)苯甲醛、N-Boc-1,4-苯二胺、嗎啉購自安耐吉化學(xué)劑有限公司；無水乙醇(分析純)、乙酸乙酯 (分析純)、石油醚 (分析純)、二氯甲烷 (分析純)購自天津歐博凱化工有限公司購進(jìn)；N,N-二甲基甲酰胺從天津市北辰方正試劑廠購進(jìn)；三氯甲烷從成都市科隆化學(xué)品有限公司購進(jìn)。200～300目柱層析硅膠(青島海洋化工公司)。所用試劑均為分析純，所用去離子水 (≥18 MΩ·cm) 由 Milli-Q 純化系統(tǒng)制備。

SHZ-D(Ⅲ)予華牌循環(huán)水真空泵；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；GKDL-20小型冷卻水循環(huán)裝置；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；PHS-3C型pH計(上海雷磁儀器廠)；ZF7三用紫外分析儀(上海予名儀器設(shè)備有限公司)；UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；Bruker AVANCE-600 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(德國)；賽默飛高分辨質(zhì)譜儀；FS5熒光光譜儀(英國)。

1.2 探針BMOA的合成

探針分子 BMOA 的有機(jī)合成參考文獻(xiàn)[32]。首先化合物MOB的合成，取原料3-(溴甲基)苯甲醛1.0 g(5 mmol)、嗎啉環(huán)0.52 g(6 mmol)和碳酸鉀1.54 g(10 mmol)溶解于適量的溶劑DMF，在70 ℃加熱條件下反應(yīng)，溶液由無色透明變?yōu)辄S色，TCL監(jiān)測，8 h后反應(yīng)結(jié)束。加入40 mL蒸餾水淬滅，用乙酸乙酯萃取三次，減壓蒸餾得到黃色油狀物(溶劑DMF因沸點(diǎn)高無法旋出)，柱層析乙酸乙酯作為洗脫劑，得到黃色晶狀固體1.06 g(5 mmol)產(chǎn)率96.96%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 10.18, 10.02, 8.25, 7.85, 7.85,7.83, 7.83, 7.82, 7.81, 7.81, 7.80, 7.69, 7.67, 7.67,7.65, 7.65, 7.59, 7.57, 7.56, 7.12, 4.37, 3.60, 3.58,3.57, 3.56, 3.42, 2.42。探針BMOA的合成，取MOB 11.0 g(4 mmol)與N-Boc-1,4-苯二胺1.05 g (5 mmol)溶解于三氯甲烷中，加入催化量的哌啶，在70 ℃回流，TCL監(jiān)測，12 h后反應(yīng)結(jié)束。加入40 mL水淬滅，CH2Cl2萃取，減壓蒸餾得到黑棕色油狀物，柱層析(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=6∶1)分離，最終得到探針BMOA黃色粉末0.21 g (0.5 mmol)，產(chǎn)率為56.6%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6), δ 9.43 (s, 1H), 8.63 (s, 1H),7.87 (s, 1H), 7.83-7.77 (m, 1H), 7.51 (d,J= 8.3 Hz,2H), 7.45 (d,J= 7.4 Hz, 2H), 7.29-7.20 (m, 2H),3.58 (t,J=4.5 Hz, 4H), 3.52(s, 2H), 2.38(d,J=5.1 Hz,4H), 1.49 (s, 9H)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6), δ 159.1, 152.8, 147.0, 136.7, 136.4, 132.1, 129.3, 129.2,128.7, 127.8, 121.7, 121.7, 121.6, 119.3, 80.6, 66.9, 63.1,53.7, 53.6, 28.4。HR-MS, C23H29N3O3-，實(shí)測值 (計算值),m/z：394.2116[M-H-]-。探針 BMOA 的合成路線見圖2所示。

圖2 探針BMOA的合成路線

1.3 熒光探針BMOA的光譜性能測

在光譜測試前，首先用DMSO溶解探針固體，配制母液為10 mmol/L 探針。再用二蒸水配制10 mmol/L PBS 緩 沖 液 (pH=7.4)及 各 待 檢 測 物 (Cys，ClO-，儲備液(100 mmol/L)。測試時，用移液槍取BMOA的儲備液，使測試的探針BMOA 濃度為5 mmol/L(VCH3CN/VPBS=1∶1)。不同濃度的待檢測物依據(jù)實(shí)驗需要按照類似的方法取其儲備液進(jìn)行配制。探針與各待檢測物混合均勻后，室溫振蕩5 min后測試熒光光譜。所用的激發(fā)波長為292 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫寬度為5.0 nm/5.0 nm。響應(yīng)時間的測定：使用熒光儀測定探針BMOA與次氯酸鈉(120 mmol/L)反應(yīng)的反應(yīng)時間。機(jī)理驗證的測定：在去離子水的體系中，加入5 mmol/L的探針BMOA，隨后加入24倍當(dāng)量的次氯酸鈉，反應(yīng)5 min后利用高分辨質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針分子BMOA對次氯酸鈉的光譜研究

在CH3CN/PBS 緩沖體系(pH=7.4，VCH3CN/VPBS=1∶1)中，如圖3(a)所示，單獨(dú)探針BMOA的紫外吸收波長是263 nm和333 nm，當(dāng)向體系中分別加入不同濃度的 NaClO(50，80，120 mmol/L)后，探針原有的紫外吸收波長消失，在292 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰，說明探針確實(shí)與次氯酸根離子發(fā)生反應(yīng)，并且有新的物質(zhì)生成。圖3(b)所示，當(dāng)向5 mmol/L的探針溶液中加入0～120 mmol/L的NaClO溶液后，探針BMOA 的熒光發(fā)射強(qiáng)度在544 nm處逐漸減弱，說明探針與次氯酸根離子發(fā)生反應(yīng)，并且是淬滅型熒光探針。

圖3 圖2探針BMOA對次氯酸鈉的紫外和熒光變化

2.2 探針分子BMOA對次氯酸鈉的滴定實(shí)驗和反應(yīng)時間

為了測試不同濃度的次氯酸根與探針BMOA的相互作用，進(jìn)行滴定實(shí)驗，如圖4所示。隨著次氯酸根離子濃度的增大，F(xiàn)544值在NaClO濃度為0～70 mmol/L呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)為0.997。根據(jù)檢出限計算公式(LOD=3σ/k，σ為白樣品連續(xù)測定10次的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)[33]，得到方法檢出為 4.13 nmol/L。上述結(jié)果說明BMOA可以高靈敏、定量檢測次氯酸。為了探究探針與次氯酸根離子的反應(yīng)時間，考察了探針BMOA 與次氯酸混合后熒光強(qiáng)度隨時間的變化情況。Figure 2B顯示，反應(yīng)體系的發(fā)射波長在544 nm處快速減弱，150 s后熒光強(qiáng)度基本不再變化。圖4(a)所示為探針BMOA對NaClO的滴定實(shí)驗、(b)所示為探針BMOA的熒光強(qiáng)度隨時間的變化關(guān)系圖。

圖4 不同濃度的次氯酸根與探針BMOA的相互作用隨時間的變化關(guān)系

2.3 探針分子BMOA對次氯酸根離子的選擇性和pH值的影響

在對探針BMOA光譜性能研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評估了探針的選擇性，如圖5所示。加入NaClO響應(yīng)之后，在最大發(fā)射波長544 nm處，熒光幾乎完全淬滅，但是加入其他分析物熒光強(qiáng)度沒有變化。由此證明，探針BMOA對次氯酸根離子具有較好的選擇性。如圖5(b)所示，沒有加入次氯酸根離子時，探針的熒光強(qiáng)度在pH=3～10的范圍內(nèi)，基本保持穩(wěn)定，說明探針BMOA在生理pH環(huán)境下可以應(yīng)用。當(dāng)加入次氯酸根離子后，在pH=5.0～7.5的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度的變化不明顯，這說明該探針在生理條件下能夠檢測生物樣品中的次氯酸根離子。

圖5 探針BMOA對次氯酸根離子的選擇性實(shí)驗和pH對探針BMOA的影響

2.4 探針分子BMOA對次氯酸檢測的機(jī)理研究

為了進(jìn)一步驗證推測的機(jī)理，即探針BMOA被次氯酸氧化釋放MOB(如圖6a是所示)，運(yùn)用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行驗證。在去離子水的體系中，加入5 mmol/L的探針BMOA，隨后加入24倍當(dāng)量的次氯酸鈉，反應(yīng)之后利用高分辨質(zhì)譜分析。如圖6b所示，檢測到了MOB的峰(m/z 206.95)，即探針被次氯酸氧化斷裂，釋放出MOB。這為探針BMOA按上述機(jī)理進(jìn)行反應(yīng)提供了有力的依據(jù)。

圖6 探針BMOA對次氯酸根離子的識別機(jī)理和與次氯酸鈉反應(yīng)后的高分辨質(zhì)譜

3 結(jié)語

本文通過利用3-(溴甲基)苯甲醛為原料，嗎啉作為溶酶體靶向基團(tuán)，設(shè)計合成了一種可以檢測溶酶體中次氯酸的熒光探針BMOA。該探針BMOA可以快速靈敏、選擇性地識別次氯酸根離子，并且其熒光信號在0～70 mmol/L次氯酸濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其檢測限僅為4.13 nmol/L。同時，探針BMOA對次氯酸根離子的響應(yīng)時間僅為150 s。利用高分辨質(zhì)譜深入探討了該熒光探針的響應(yīng)機(jī)理即熒光探針BMOA的“C=N”被次氯酸氧化而發(fā)生斷裂，從而使得熒光發(fā)生淬滅。