曹慶雷

疲勞是一種由外周和中樞系統(tǒng)雙重因素影響的復(fù)雜現(xiàn)象，如糖原的耗竭、心血管勞損等（Neher et al.，2006）。運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制存在多種假說(shuō)，包括中樞神經(jīng)遞質(zhì)失衡、內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)、氨基酸、離子代謝紊亂、自由基增多、能源衰竭和神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)的平衡打破等（張?zhí)N琨等，2006）。Matsui等（2011）報(bào)道，長(zhǎng)期的低血糖運(yùn)動(dòng)會(huì)引起腦糖原降低，導(dǎo)致單胺代謝的激活引起中樞疲勞。長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的疲勞以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous sys‐tem，CNS）出現(xiàn)的保護(hù)性抑制為主，其中CNS的神經(jīng)遞質(zhì)參與了疲勞的產(chǎn)生與發(fā)展。過(guò)去的運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞研究多集中在腦和脊髓的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能方面，而運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞是如何激活、是否存在于人類(lèi)運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的相關(guān)基因群中，尚不清楚。運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞是機(jī)體對(duì)外界刺激做出的保護(hù)性反應(yīng)，其調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，且基因表達(dá)存在著時(shí)間和組織特異性。因此，采用傳統(tǒng)的核酸印記雜交以及RT-PCR等方法難以獲得足夠的信息，特別是無(wú)法了解基因間的相互關(guān)系（Fernstrom et al.，2006）。

熱預(yù)適應(yīng)是指將實(shí)驗(yàn)體短時(shí)間內(nèi)多次放置在高溫條件下進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，從而使實(shí)驗(yàn)體的表皮和體內(nèi)溫度升高，為后續(xù)運(yùn)動(dòng)或?qū)嶒?yàn)做準(zhǔn)備，這也成為研究運(yùn)動(dòng)疲勞的一種實(shí)驗(yàn)手段（Guy et al.，2015；Tyler et al.，2016；Weller et al.，2007）。熱預(yù)適應(yīng)作為一種安全有效且操作簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)手段，可減輕實(shí)驗(yàn)體在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的機(jī)體損傷，比如缺血預(yù)適應(yīng)后可保護(hù)腦組織、肌肉組織（劉亮等，2001；張銀環(huán)等，1995）。陳開(kāi)祥等（2007）研究表明，熱預(yù)適應(yīng)可減輕心肌細(xì)胞損傷，從而起到一定的保護(hù)作用。熱預(yù)適應(yīng)作用的主要原理為：環(huán)境溫度的改變使得皮膚等表皮器官作為接收器，將熱應(yīng)激信號(hào)傳遞至下丘腦等相關(guān)區(qū)域，下丘腦整合為熱敏元信號(hào)釋放相關(guān)激素，影響中樞神經(jīng)甚至整個(gè)機(jī)體，引發(fā)中樞性疲勞或運(yùn)動(dòng)性疲勞。有研究顯示，當(dāng)機(jī)體達(dá)到中樞性疲勞或運(yùn)動(dòng)性疲勞時(shí)，會(huì)提高多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）的活性來(lái)抑制中樞性疲勞，提高運(yùn)動(dòng)耐受力，從而延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間（張念云 等 ，2012；Hasegawa et al.，2008；Takatsu et al.，2010）。此外，機(jī)體還會(huì)產(chǎn)生一系列的反應(yīng)，例如釋放相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)、改變相應(yīng)受體表達(dá)從而調(diào)整受體數(shù)量，由此進(jìn)行全身性調(diào)節(jié)等以適應(yīng)環(huán)境的改變（胡琰茹 等，2015；Fuller et al.，1998；Rodrigues et al.，2003；Walters et al.，2000）。機(jī)體在長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生此種反應(yīng)調(diào)節(jié)后，必定會(huì)改變自身原有調(diào)節(jié)機(jī)制，適應(yīng)環(huán)境變化，推測(cè)其原有調(diào)節(jié)機(jī)制可能與某些基因的變化相關(guān)，變化的基因可能存在于上調(diào)基因或改變的轉(zhuǎn)錄本中。

在機(jī)體維持自身穩(wěn)態(tài)以適應(yīng)外界環(huán)境的過(guò)程中，必然會(huì)對(duì)作為運(yùn)動(dòng)承受方及發(fā)出方的肌肉組織產(chǎn)生影響。主要的過(guò)程為：經(jīng)下丘腦區(qū)域激發(fā)產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)作用于相應(yīng)效應(yīng)器以刺激其釋放激素與肌肉細(xì)胞上的受體結(jié)合，影響肌肉細(xì)胞內(nèi)部基因的表達(dá)，若肌肉細(xì)胞內(nèi)部失衡，下丘腦分泌相關(guān)激素作用于大腦皮層，抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放，使運(yùn)動(dòng)能力下降、運(yùn)動(dòng)時(shí)間減少（盧文彪，2010）。大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生的神經(jīng)和中樞疲勞的信號(hào)被大腦皮層接收從而釋放神經(jīng)遞質(zhì)，進(jìn)行神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)，使機(jī)體逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，達(dá)到自身穩(wěn)態(tài)平衡（Neher et al.，2006）。大鼠神經(jīng)遞質(zhì)和激素在全身性調(diào)節(jié)下趨于平衡狀態(tài)，有可能適應(yīng)了實(shí)驗(yàn)的熱應(yīng)激條件，推遲了運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生的時(shí)間（曹慶雷等，2019）。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析獲得的差異基因與相關(guān)參考的注釋信息進(jìn)行比對(duì)，對(duì)因熱預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生改變的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析總結(jié)（竇金煥，2016），了解熱預(yù)適應(yīng)所影響的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組，該生物學(xué)方法在醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)學(xué)領(lǐng)域的研究，今后可能廣泛應(yīng)用于大鼠甚至人體。肌肉細(xì)胞作為運(yùn)動(dòng)的承載者，與運(yùn)動(dòng)及一切生命活動(dòng)的關(guān)系最為緊密（謝永濤等，2011），因此本研究將大鼠肌肉細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并分析轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的基因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒑蜆悠凡杉?/h3>

成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量230～260 g（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司），飼養(yǎng)于首都師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大鼠飼養(yǎng)房，自由飲水、飲食，飼養(yǎng)房溫度18℃～24℃，空氣相對(duì)濕度40%～60%，晝夜節(jié)律正常。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熱預(yù)適應(yīng)處理

大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和熱預(yù)適應(yīng)組，每組12只。將熱預(yù)適應(yīng)組大鼠置于42℃水中，使其不間斷水浴運(yùn)動(dòng)，使大鼠內(nèi)臟器官溫度升高至肛溫42℃維持15 min，期間保持大鼠呼吸通暢。運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，將大鼠移出水浴鍋，全身擦干，置于常溫下1 h，再次水浴運(yùn)動(dòng)至肛溫42℃維持15 min。每天進(jìn)行3次，連續(xù)7天。對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)在室溫25℃的環(huán)境中，不做任何處理。所有的實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)首都師范大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)方案符合首都師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)程。

1.2.2 RNA提取

取熱預(yù)適應(yīng)組大鼠和對(duì)照組大鼠的肌肉組織，利用Trizol試劑（Life Techonology公司，美國(guó)）提取總RNA，置于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。提取的各RNA樣品均以無(wú)DNase的DNaseI（TaKaRa公司，大連）進(jìn)行處理，以消除可能存在的基因組DNA污染，然后分別等量混合3個(gè)對(duì)照組和熱預(yù)適應(yīng)組的RNA樣品（30 μg）。使用Oligotex mRNA小量提取試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)）分離和純化mRNA。通過(guò) Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Nano Kitb Agilent公司，美國(guó)）檢測(cè)total RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片段大小。純度使用紫外分光光度計(jì)NanoDrop TM進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序

采用mRNA富集法對(duì)total RNA進(jìn)行處理，用帶有Ol‐igodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA以獲得片段化的RNA，隨機(jī)的N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用瓊脂糖凝膠電泳篩選目的片段，通過(guò)特異的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增富集所得到的cDNA文庫(kù)。高通量測(cè)序由廣州華大基因生物科技有限公司提供測(cè)序服務(wù)，使用BGISEQ-500進(jìn)行文庫(kù)的測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SOAPnuke軟件對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，將其包含的低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過(guò)高的測(cè)序片段進(jìn)行過(guò)濾篩選，經(jīng)數(shù)據(jù)過(guò)濾后獲得高質(zhì)量測(cè)序片段。使用Bowtie2將過(guò)濾后測(cè)序片段與參考序列進(jìn)行比對(duì)，以統(tǒng)計(jì)基因比對(duì)率，之后再使用RSEM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。使用R語(yǔ)言軟件里的cor函數(shù)計(jì)算每?jī)蓚€(gè)樣品之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。根據(jù)基因本體（gene ontology，GO）注釋結(jié)果以及官方分類(lèi)，將差異基因進(jìn)行功能分類(lèi)，根據(jù)KEGG注釋結(jié)果以及官方分類(lèi)，將差異基因進(jìn)行生物通路分類(lèi)。使用PossionDis算法進(jìn)行差異基因檢測(cè)，差異表達(dá)基因默認(rèn)定義為FDR≤0.001且差異倍數(shù)在2倍以上。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)

用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA先進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。對(duì)照組和熱預(yù)適應(yīng)組樣品的OD260/280值均分別為2.00和2.02；RIN值分別為8.80和8.40，28S/18S值分別為1.20和1.10。這表明本研究所用的樣品組織RNA質(zhì)量較好，滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求。

由于測(cè)序儀、試劑、樣品質(zhì)量等均能影響堿基質(zhì)量測(cè)序，因此原始數(shù)據(jù)包含低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過(guò)高的reads，為保證測(cè)序reads的準(zhǔn)確性需要確定堿基質(zhì)量分布。正常情況下，reads中的前幾個(gè)堿基質(zhì)量值不高，是因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄時(shí)隨機(jī)引物不能很好地結(jié)合RNA模板；測(cè)序長(zhǎng)度的增加在一定范圍內(nèi)有助于提高測(cè)序質(zhì)量，但長(zhǎng)度達(dá)到一定閾值后，由于測(cè)序試劑的消耗，高質(zhì)量堿基的比例會(huì)降低。從整體上看，如果低質(zhì)量（Quality＜20）的堿基比例較低，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較好（表2）。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)Table 2 Satistical Results of Sequencing Data

從上述結(jié)果可知，通過(guò)測(cè)序，共獲得了219.72 Mb條的reads，總堿基數(shù)為10.99 Gb，每個(gè)樣品均獲得了10 Gb以上的堿基，Q20在97%以上，Q30在90%以上。這表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的結(jié)果質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)結(jié)果分析。得到過(guò)濾后reads之后，使用HISAT序列比對(duì)軟件將過(guò)濾后reads比對(duì)到參考基因組序列，結(jié)果如表3所示。兩個(gè)樣品分別獲得110 454 472和109 271 956個(gè)reads，以大鼠基因組為參考進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，平均每個(gè)樣品的比對(duì)率達(dá)到92.53%。比對(duì)到參考基因組某一位置過(guò)濾后reads平均值為67.50%。兩個(gè)樣品的reads與參考基因組的比對(duì)效率較高，說(shuō)明本次測(cè)序結(jié)果具有較強(qiáng)可靠性。

表3 參考基因組對(duì)比結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical Table of Comparison Results of Reference Genome

2.2 基因表達(dá)量分析

2.2.1 基因比對(duì)與表達(dá)

使用Bowtie2將過(guò)濾后reads比對(duì)到參考序列，之后再使用RSEM轉(zhuǎn)錄組分析軟件計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。以大鼠的表達(dá)基因序列為參考基因，對(duì)比及表達(dá)結(jié)果表明，reads比對(duì)到參考基因的比率平均為84.26%，reads比對(duì)到參考基因唯一位置的比例平均值為65.22%（表4）。說(shuō)明兩組樣本的reads對(duì)表達(dá)基因序列的比對(duì)率較高，可以用于后期表達(dá)差異分析。從表5可以看出，在基因數(shù)、轉(zhuǎn)錄本數(shù)量上，兩組樣本間都存在明顯差異，熱預(yù)適應(yīng)組樣本的基因數(shù)量較對(duì)照組多，特別是新轉(zhuǎn)錄本（新轉(zhuǎn)錄本是指在參考注釋信息中未能找到已知注釋信息的轉(zhuǎn)錄本，即新轉(zhuǎn)錄本可能屬于已知基因的新的剪接亞型，或者屬于未知基因的新轉(zhuǎn)錄本）。這些新的轉(zhuǎn)錄本預(yù)示新的蛋白編碼，這些蛋白很可能在延緩肌肉疲勞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

表4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)Table 4 Quality Testing of Transcriptome Sequencing Data

表5 基因和轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics of Gene and Transcripts

2.2.2 差異表達(dá)基因的篩選

為了展示基因表達(dá)量的分布，對(duì)FPKM（FPKM＜1、FPKM 1～10、FPKM＞10）的3種情況進(jìn)行了基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)。通過(guò)公式計(jì)算得到熱預(yù)適應(yīng)組及對(duì)照組大鼠肌肉組織FPKM值（圖1）。對(duì)照組FPKM＜1的基因占36.63%，F(xiàn)PKM＞10的基因占23.25%。熱預(yù)適應(yīng)組FPKM＜1的基因占34.49%，F(xiàn)PKM＞10的基因占28.18%。同時(shí)看出，已知基因和新基因在熱預(yù)適應(yīng)組中表達(dá)量高于對(duì)照組，說(shuō)明大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后刺激了某些已知基因提高其表達(dá)量，或是誘導(dǎo)了某些新基因的表達(dá)，參與到延緩疲勞的過(guò)程中。

圖1 基因表達(dá)圖Figure 1.Gene Expression Map

2.2.3 差異表達(dá)基因檢測(cè)

為檢測(cè)大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后的基因表達(dá)差異，進(jìn)一步使用IDEG6軟件，從差異倍數(shù)和顯著水平進(jìn)行評(píng)估，將差異倍數(shù)在2倍以上且顯著水平為P＜0.05定義為基因表達(dá)差異顯著。根據(jù)火山圖（圖2）所示，對(duì)照組和熱預(yù)適應(yīng)組存在較多的差異表達(dá)基因。與對(duì)照組相比，在熱預(yù)適應(yīng)后的肌肉組織中共獲得2 267個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)下調(diào)的基因555個(gè)，表達(dá)上調(diào)的基因1 712個(gè)（圖3）。表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)目大約是表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)目的3倍，表明經(jīng)過(guò)熱預(yù)適應(yīng)處理后，跟對(duì)照組相比，更多的基因表達(dá)上調(diào)去適應(yīng)這種溫度的變化。換言之，熱預(yù)適應(yīng)處理過(guò)程中很多基因需要上調(diào)表達(dá)。表達(dá)量上調(diào)最多的基因是α-微管蛋白特異性1c鏈（tubulin specific 1C chain，TUBA1C），與對(duì)照組相比上調(diào)432倍，TUBA1C是組成微管的重要蛋白，微管蛋白在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中具有重要作用，熱預(yù)適應(yīng)可以促進(jìn)微管蛋白的表達(dá)升高，表明熱預(yù)適應(yīng)也可以改變肌肉組織相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)對(duì)熱應(yīng)激的適應(yīng)。表達(dá)量下調(diào)最多的基因是乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶（acetyl-Co A C-acetyl‐transferase，AACT），是參與細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要功能酶，與對(duì)照組相比，其在熱預(yù)適應(yīng)后表達(dá)量顯著降低533倍，表明熱預(yù)適應(yīng)也會(huì)影響肌肉組織中相關(guān)蛋白酶的表達(dá)。這些結(jié)果顯示，熱預(yù)適應(yīng)處理組和對(duì)照組差異基因表達(dá)模式相差較大。在高溫處理后，大量基因表達(dá)發(fā)生明顯的變化，上調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)量較多，這可能參與了大鼠高溫應(yīng)答的互作通路。

圖2 差異表達(dá)基因火山圖Figure 2. Volcanic plot of Differentially Expressed Genes

圖3 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)Figure 3.Statistics of Differentially Expressed Genes

2.2.4 差異表達(dá)基因GO功能分析

根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)其GO功能進(jìn)行分類(lèi)及富集分析。對(duì)GO分析的結(jié)果表明，差異表達(dá)基因按功能可以分為細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程三大類(lèi)，生物學(xué)過(guò)程所占比例最多。在生物學(xué)過(guò)程中，與生物體代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的過(guò)程（如代謝過(guò)程、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)、刺激應(yīng)答等過(guò)程）最多，表明在熱預(yù)適應(yīng)后大鼠的肌肉組織中有大量的代謝調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，從而適應(yīng)此過(guò)程。在細(xì)胞組分分類(lèi)中，細(xì)胞部分和細(xì)胞器、細(xì)胞膜所占比例最多，總體而言，組分類(lèi)基因變化少于生物學(xué)過(guò)程基因，通過(guò)熱預(yù)適應(yīng)處理1周，該過(guò)程中肌肉細(xì)胞發(fā)生響應(yīng)，但是組分變化的作用低于代謝調(diào)控類(lèi)基因變化的作用。在分子功能中，上調(diào)基因發(fā)揮的主要功能是催化細(xì)胞中相關(guān)酶的活性，說(shuō)明熱預(yù)適應(yīng)過(guò)程中相關(guān)的催化活性蛋白或者結(jié)合蛋白發(fā)揮了重要作用，這些蛋白可能通過(guò)分子功能的改變適應(yīng)外界環(huán)境的變化。此外，在GO功能分類(lèi)中，與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)過(guò)程、代謝過(guò)程、刺激應(yīng)答過(guò)程、分子或組織的生物合成過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程等。由此可見(jiàn)，經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后的大鼠產(chǎn)生的差異轉(zhuǎn)錄組會(huì)作用到各種基因類(lèi)型，共同參與細(xì)胞或者機(jī)體適應(yīng)環(huán)境。

根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)GO功能進(jìn)行分類(lèi)及富集分析，GO功能對(duì)應(yīng)的差異表達(dá)基因上、下調(diào)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。通過(guò)“基因本體功能富集”模塊對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，對(duì)每類(lèi)基因數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，篩選出PDF≤0.01的通路。大鼠在熱預(yù)適應(yīng)后整體基因都處于上調(diào)狀態(tài)，下調(diào)基因數(shù)目較少，可以看出，在生物過(guò)程中，上調(diào)基因的GO terms與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生物調(diào)節(jié)及代謝過(guò)程有關(guān)，主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，下調(diào)基因主要參與基因調(diào)控。在細(xì)胞組分中，上、下調(diào)基因主要參與生成細(xì)胞器、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過(guò)程。在分子功能中，上調(diào)基因主要參與催化細(xì)胞中相關(guān)酶的活性與結(jié)合活性，下調(diào)基因參與細(xì)胞器的構(gòu)成。應(yīng)激反應(yīng)中的差異表達(dá)基因富集較為顯著，表明大鼠肌肉在熱預(yù)適應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生了大量參與調(diào)控代謝的活動(dòng)，為后續(xù)延緩運(yùn)動(dòng)疲勞提供了可能性。

圖4 差異表達(dá)基因GO功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)Figure 4.GO Function Classification Statistics of Differentially Expressed Genes

2.2.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，我們對(duì)其進(jìn)行KEGG生物通路分類(lèi)以及富集分析。將基因根據(jù)參與的KEGG代謝通路分為6個(gè)部分：細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類(lèi)疾病（僅限動(dòng)物）、代謝、有機(jī)系統(tǒng)（圖5）（袁姣，2015）。差異基因在細(xì)胞過(guò)程中的主要功能是運(yùn)輸和分解代謝，在環(huán)境信息處理中參與信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)分子交互過(guò)程，在遺傳信息處理中主要參與遺傳信息的折疊、排序和退化以及翻譯過(guò)程，在代謝方面主要參與脂質(zhì)代謝，在有機(jī)系統(tǒng)中主要參與免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)。由此可見(jiàn)，經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后的大鼠轉(zhuǎn)錄組發(fā)生的改變，主要體現(xiàn)在提高細(xì)胞的運(yùn)輸和代謝、增強(qiáng)信號(hào)分子傳導(dǎo)效率、參與遺傳信息表達(dá)過(guò)程和提高脂質(zhì)代謝的過(guò)程中。熱預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠肌肉組織轉(zhuǎn)錄組的影響主要在于提高細(xì)胞代謝、增強(qiáng)傳導(dǎo)效率，從而延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的產(chǎn)生（馬國(guó)強(qiáng)等，2014）。

圖5 差異基因的通路分類(lèi)Figure 5.Pathway Classification of Differential Genes

使用R語(yǔ)言軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析，選取10條差異基因顯著的信號(hào)通路進(jìn)行解釋?zhuān)ū?）?？梢钥闯?，大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后差異基因主要參與蛋白酶體、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）受體相互作用、膀胱癌、肝纖維化、血管重建、促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖與侵襲等過(guò)程。其中，蛋白酶體富集最為顯著，其功能主要涉及細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等。

表6 差異表達(dá)基因通路功能富集部分結(jié)果示例Table 6 Examples of the Results of Pathway Functional Enrichment of Differentially Expressed Genes

將富集明顯的30條信號(hào)通路中基因的上、下調(diào)情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)樣本富集通路差異基因上調(diào)的基因主要存在于蛋白酶體和谷胱甘肽（glutathione，GSH）代謝過(guò)程。蛋白質(zhì)是生命功能的體現(xiàn)者，而蛋白酶體直接影響某些蛋白質(zhì)的更新，其中包括錯(cuò)誤折疊蛋白和許多在生命活動(dòng)中起重要作用的蛋白質(zhì)，如p53、cyclin等。蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解通過(guò)泛素介導(dǎo)，泛素識(shí)別要被降解的蛋白質(zhì)，然后將這種蛋白質(zhì)送入蛋白酶體進(jìn)行降解。這就說(shuō)明，參與蛋白合成和降解的基因表達(dá)都是上調(diào)的，換言之，經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后，機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中很可能通過(guò)提高代謝率緩解疲勞。

GSH作為一種細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)，既是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及丙糖脫氫酶的輔酶，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，并能激活多種酶，如巰基酶-輔酶等，從而促進(jìn)糖類(lèi)、脂肪和蛋白質(zhì)代謝。同時(shí)，GSH通過(guò)巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合，可直接使自由基還原成酸性物質(zhì)，從而加速自由基的排泄，并對(duì)抗自由基，減輕其對(duì)重要臟器的損害。Haddad等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，GSH參與了脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)及I-κB/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。NF-κB是具有多向性調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)分子，參與調(diào)控多種因子的基因表達(dá)，在免疫調(diào)控、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡中起重要作用。NF-κB還可進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，通過(guò)迅速合成I-κB終止轉(zhuǎn)錄。NF-κB表達(dá)廣泛，功能及調(diào)節(jié)較為復(fù)雜，而且能夠誘導(dǎo)NF-κB和DNA結(jié)合的誘導(dǎo)物很多，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞黏附和增生均有重要的調(diào)節(jié)作用。

3 討論

本研究對(duì)熱預(yù)適應(yīng)的大鼠肌肉組織轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行分析，經(jīng)測(cè)序得到17 951個(gè)基因，已知的基因17 616個(gè)，預(yù)測(cè)的新基因435個(gè)；同時(shí)，測(cè)序得到的9 825個(gè)新轉(zhuǎn)錄本中，8 325個(gè)屬于已知蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型，435個(gè)屬于新的蛋白編碼基因，剩下的1 065個(gè)屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA。在熱預(yù)適應(yīng)后的大鼠肌肉組織中共獲得2 267個(gè)差異表達(dá)基因，其中下調(diào)基因555個(gè)，上調(diào)基因1 712個(gè)。進(jìn)一步將這些差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG代謝途徑注釋。GO功能注釋分類(lèi)表明，肌肉組織不同生理狀態(tài)差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞相關(guān)類(lèi)別（細(xì)胞組分、細(xì)胞器等）、膜相關(guān)類(lèi)別（包括膜、膜部分）、分子綁定、催化活性、分子傳感器活性、細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程等。這些結(jié)果表明，參與大鼠肌肉生理活動(dòng)的差異基因除了集中于細(xì)胞內(nèi)，還廣泛分布于生物調(diào)節(jié)和代謝過(guò)程、刺激應(yīng)答過(guò)程、多生物體過(guò)程或發(fā)育過(guò)程、生物過(guò)程正反饋調(diào)節(jié)、細(xì)胞組分或生物合成信號(hào)通路等。在生物過(guò)程中，上調(diào)基因的GO terms與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生物調(diào)節(jié)及代謝過(guò)程有關(guān)，主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。下調(diào)基因主要參與基因調(diào)控。在細(xì)胞組分中，上、下調(diào)基因主要參與生成細(xì)胞器、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過(guò)程。在分子功能中，上調(diào)基因主要參與催化細(xì)胞中相關(guān)酶的活性、結(jié)合活性，下調(diào)基因參與細(xì)胞器的構(gòu)成。應(yīng)激反應(yīng)中的差異表達(dá)基因富集較為顯著，表明大鼠肌肉在熱預(yù)適應(yīng)過(guò)程中存在大量的代謝調(diào)控。此外，在肌肉細(xì)胞的表達(dá)基因中，分子綁定功能類(lèi)別占有較高比例，進(jìn)一步證實(shí)分子綁定功能類(lèi)別在肌肉中具有顯著表達(dá)，推測(cè)分子綁定在大鼠肌肉的生理活動(dòng)中可能具有重要的作用。對(duì)差異基因進(jìn)行通路富集分析，可以確定差異表達(dá)基因參與的主要代謝途徑和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以及與其他基因的相互作用。本研究KEGG通路分析表明，差異表達(dá)基因共涉及326個(gè)通路，其中蛋白酶體、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和ECM受體相互作用等4個(gè)通路被顯著富集。

蛋白酶體主要參與細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、抗原提呈、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥、炎癥、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生等（Javitt et al.，2019）。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）由HIF-α和HIF-β兩個(gè)亞基組成，在低氧下能激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞、組織生長(zhǎng)發(fā)育和生理應(yīng)激，以及某些病理過(guò)程中具有重要的作用。近年來(lái)，有關(guān)HIF-1在細(xì)胞低氧應(yīng)激時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是HIF-α介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究取得了巨大進(jìn)展。HIF-1可以上調(diào)血管系統(tǒng)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，如促進(jìn)血管生成的VEGF及其受體的表達(dá)，這些基因的表達(dá)能夠誘導(dǎo)某些血管收縮因子的產(chǎn)生，如一氧化氮合酶（iNOS）ET-1和血紅素氧化酶1（HO-1）等，從而增加血流（王萍萍等，2011），為肌肉運(yùn)動(dòng)提供更多氧氣，延緩運(yùn)動(dòng)疲勞。

PI3K（phosphatidylinositide 3-kinases）是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成，且與癌基因的產(chǎn)物相關(guān)。PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。AKT又稱(chēng)PKB（protein kinase B），是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在多種細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是PI3K重要的下游分子，包括至少3種形式，分別為AKT1、AKT2和AKT3。它們對(duì)于調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、存活以及糖代謝起到重要的作用，而且此信號(hào)通路只存在于經(jīng)刺激后的個(gè)體（黃秀蘭等，2008），這就解釋了大鼠在熱預(yù)適應(yīng)后，經(jīng)此信號(hào)通路既可以調(diào)控肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)，又可增加糖代謝為機(jī)體提供能量，從而達(dá)到延緩疲勞的作用。

細(xì)胞外基質(zhì)是組成間質(zhì)和上皮血管中基質(zhì)的不溶性結(jié)構(gòu)成分，主要有膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等。研究表明，ECM可影響細(xì)胞分化、增殖、黏附、形態(tài)發(fā)生和表型表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。

已有研究發(fā)現(xiàn)，中樞性疲勞與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分泌有關(guān)（曹慶雷等，2019；楊瑾，2013），了解熱預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的新轉(zhuǎn)錄本與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分泌有何關(guān)系，或許可以為延緩疲勞產(chǎn)生、研究預(yù)防措施和治療方法有一定的推動(dòng)作用。有研究顯示，熱預(yù)適應(yīng)可改善神經(jīng)遞質(zhì)、延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞出現(xiàn)（王峰，2008）。雖然改變神經(jīng)遞質(zhì)的具體機(jī)制還不清楚，但實(shí)驗(yàn)已證明，熱預(yù)適應(yīng)對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)網(wǎng)絡(luò)造成了影響，使實(shí)驗(yàn)體預(yù)先進(jìn)入調(diào)節(jié)機(jī)制（鄧聰穎，2007）。而本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱預(yù)適應(yīng)也可通過(guò)外界環(huán)境造成的體液調(diào)節(jié)影響激素分泌，甚至造成新轉(zhuǎn)錄本的出現(xiàn)影響實(shí)驗(yàn)體本身。但研究結(jié)果都表明，外界刺激使得實(shí)驗(yàn)體產(chǎn)生了適應(yīng)環(huán)境的改變。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，可變剪接需要用到已知的參考基因組序列和已經(jīng)注釋的可變剪接事件（王正志等，2006），由于注釋基因組對(duì)可變剪接注釋不夠全面，因此所得結(jié)論和研究的深度并不能完全相符，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及實(shí)驗(yàn)研究的深入，研究結(jié)果也將不斷推進(jìn)。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后的肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，探討了大鼠不同生理狀態(tài)下肌肉組織差異表達(dá)基因的數(shù)量，獲得了差異表達(dá)基因的功能、分類(lèi)和代謝通路，為豐富大鼠經(jīng)運(yùn)動(dòng)處理后肌肉組織轉(zhuǎn)錄組信息、探究熱預(yù)適應(yīng)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄組的影響以及揭示神經(jīng)遞質(zhì)在運(yùn)動(dòng)疲勞過(guò)程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。