王 穎 張 曲 韋靖婧 代仕梅 陳長(zhǎng)安

（資陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 資陽(yáng) 641399）

化妝品常見(jiàn)添加的抗生素主要有氯霉素類、甲硝唑、四環(huán)素類、喹諾酮類咪唑類等。這些成分最常出現(xiàn)在祛痘抗粉刺類、祛螨類化妝品中。祛痘抗粉刺類化妝品是近年來(lái)檢測(cè)出非法添加抗生素最多的化妝品品種。這與痘痘（痤瘡）發(fā)病原理有關(guān)。痤瘡的發(fā)生主要與皮脂分泌過(guò)多、毛囊皮脂腺導(dǎo)管堵塞、細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)等因素密切相關(guān)，而局部外用抗生素本身就是治療痘痘的有效方式之一。但是人體長(zhǎng)期接觸含抗生素的化妝品，易引起接觸性皮炎、抗生素過(guò)敏等癥狀，易產(chǎn)生耐藥性。藥物殘留還可能導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)等。化妝品的檢測(cè)規(guī)范，都將抗生素列為禁用物質(zhì)，即不得作為化妝品原料使用。

1 現(xiàn)行的檢測(cè)規(guī)范檢測(cè)條件試驗(yàn)情況

現(xiàn)行的檢測(cè)規(guī)范給出了鹽酸美滿霉素、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氯霉素6 種抗生素和甲硝唑7種組分的測(cè)試方法。但方法中混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液的配制中，未給出甲醇及0.1mol/L鹽酸溶液的具體用量，實(shí)際操作過(guò)程中只能一步一步嘗試，無(wú)法讓試驗(yàn)人員進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作；按照其給出的方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽酸美滿霉素色譜峰出現(xiàn)了雙峰且鹽酸多西環(huán)素與氯霉素的色譜峰的分離度不能達(dá)到1.5（色譜圖見(jiàn)圖1），用現(xiàn)行檢測(cè)規(guī)范給出的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法對(duì)鹽酸美滿霉素等七種成分進(jìn)行準(zhǔn)確的分離和定量，所以需要對(duì)該檢測(cè)方法的條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 現(xiàn)行檢測(cè)規(guī)范給出的檢測(cè)方法色譜圖

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

樣品為膏霜類祛痘抗粉刺產(chǎn)品，10批（S1-S10）購(gòu)于本市內(nèi)的各大型化妝品連鎖門店，化妝品的外觀標(biāo)識(shí)均符合相關(guān)規(guī)定；近年來(lái)網(wǎng)絡(luò)電商平臺(tái)發(fā)展迅速，尤其是直播電商購(gòu)物風(fēng)頭正勁，但是直播電商購(gòu)物經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)商家或者是主播虛假夸大宣傳、商品質(zhì)量差、以次充好、假冒偽劣等情況，所以本試驗(yàn)特選取10批樣品（S11~S12）購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)（包括直播帶貨平臺(tái)）中，所購(gòu)10批樣品中存在一批未標(biāo)注生產(chǎn)許可證號(hào)，兩批標(biāo)注有禁止用語(yǔ)（醫(yī)療術(shù)語(yǔ)）的情況。

鹽酸、磷酸、草酸優(yōu)級(jí)純：成都市科龍化工試劑廠；乙腈和甲醇為色譜純：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；水為超純水；鹽酸美滿霉素、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氯霉素對(duì)照品來(lái)源于MANHAGE，甲硝唑?qū)φ掌穪?lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

Agilent1260高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器）：安捷倫公司；十萬(wàn)分之一電子天平：梅特勒；pH計(jì)：梅特勒；超純水機(jī)；超聲波清洗器等。

2.2 方法

色譜柱：日本島津 Shim-pack VP-ODS 4.6mm×250 mm，反相柱5μm，柱溫：30℃，流速：0.8mL/min，進(jìn)樣量：10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)；268nm，流動(dòng)相：0.003mol/L草酸溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）∶乙腈 ∶甲醇（70 ∶10∶20）。

稱取7種抗生素對(duì)照品適量，用甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（7∶3）溶液溶解，配制質(zhì)量濃度為250 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再逐級(jí)稀釋成濃度約為2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和50mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別吸取上述溶液10μL注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，以峰面積A對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸（為質(zhì)量濃度，為峰面積），線性方程、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1，由表1可知7種抗生素的回歸方程線性較好，相關(guān)系數(shù)均在0.997以上。

表1 7種抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)

準(zhǔn)確稱取樣品 2.5 g（ 2份）于25mL具塞比色管中，加入甲醇 ∶鹽酸（0.01mol/L）（7 ∶3）溶液20mL，振搖均勻，超聲提取30min，冷卻至室溫后定容至刻度，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，濾液作為供試品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 優(yōu)化后質(zhì)量濃度

優(yōu)化條件后質(zhì)量濃度為5mg/L 7種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，見(jiàn)圖2。

圖2 優(yōu)化條件后質(zhì)量濃度為5mg/L 7種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一不含待測(cè)組分的樣品6份，精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.50ml，按照供試品溶液的制備方法和色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別記錄6份樣品中鹽酸美滿霉素、甲硝唑、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素和氯霉素7種抗生素的峰面積，七種抗生素6份樣品中峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.57%、0.55%、0.97%、0.86%、1.05%、0.78%、0.88%，表明其重現(xiàn)性良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重現(xiàn)性試驗(yàn)的一份供試品溶液，室溫放置，分別在0h、2h、4h、8h、12h、24h按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別記錄鹽酸美滿霉素、甲硝唑、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素和氯霉素7種抗生素的峰面積，七種抗生素在0h、2h、4h、8h、12h、24h的色譜峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.85%、0.65%、1.08%、0.93%、1.12%、1.67%、1.30%，表明其穩(wěn)定性良好。

3.4 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度以加標(biāo)回收率表示，稱取不含待測(cè)組分的同一樣品9份，3份精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.50mL，3份精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00mL，3份精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.50mL，按照供試品溶液的制備方法制成3組不同濃度的樣品做三水平三平行的添加回收試驗(yàn)。記錄測(cè)定的峰面積，計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明7種抗生素的平均回收率為101.24%~109.29%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.36%~1.74%（=3），平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見(jiàn)表2。

表 2 7 種抗生素的平均回收率和精密度（n=3）

3.5 方法檢出限與定量限

以信噪比（/）為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，鹽酸美滿霉素、甲硝唑、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素和氯霉素7種抗生素的檢出限分別為2.81mg/kg、3.68mg/kg、4.29mg/kg、2.65mg/kg、2.93mg/kg、3.82mg/kg和1.89mg/kg；以信噪比（/）為10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，鹽酸美滿霉素、甲硝唑、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素和氯霉素7種抗生素的定量限分別為9.37mg/kg、12.27mg/kg、14.30mg/kg、8.83mg/kg、9.77mg/kg、12.73mg/kg和6.30mg/kg。

3.6 樣品含量測(cè)定

20個(gè)樣品，每個(gè)樣品各平行稱取2份，每份約2.5g精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取制成的供試品溶液10μL注入液相色譜儀中，記錄7種組分的峰面積，利用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，各樣品的含量分別為S1：未檢出；S2：未檢出；S3：未檢出；S4：未檢出；S5：未檢出；S6：未檢出；S7：未檢出；S8：未檢出；S9：未檢出；S10：未檢出；S11：未檢出；S12：未檢出；S13：檢出甲硝唑，含量為546.46mg/kg；S14：未檢出；S15：未檢出；S16：未檢出；S17：未檢出；S18：未檢出；S19：未檢出；S20：未檢出。

4 分析方法的確定

4.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制溶劑及樣品制備用溶劑的選擇

由于0.01mol/L的鹽酸溶液的pH值為2.0，最接近流動(dòng)相的pH值所以選擇0.01mol/L的鹽酸溶液作為考察的對(duì)象，并選擇了甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（7∶3）、甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（6∶4）、甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（5∶5）三個(gè)比例進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)在配制混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液溶劑為甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（7∶3）時(shí)混合標(biāo)準(zhǔn)品均完全溶解，而溶劑為甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（6∶4）、甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（5∶5）時(shí)混合標(biāo)準(zhǔn)品有部分未溶解，因此，選擇甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（7∶3）溶液作為混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制溶劑。將其作為樣品制備用溶劑，發(fā)現(xiàn)其也能很好地提取出7種待測(cè)組分，為了簡(jiǎn)化溶液的配制所以同時(shí)選擇其作為樣品制備用溶劑。

4.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

為了解決檢測(cè)時(shí)鹽酸美滿霉素色譜峰出現(xiàn)了雙峰且鹽酸多西環(huán)素與氯霉素的色譜峰的分離度不能達(dá)到1.5的問(wèn)題，筆者將從流動(dòng)相pH值、草酸溶液濃度、流動(dòng)相中各成分比例以及是否采取梯度洗脫等方面對(duì)流動(dòng)相條件進(jìn)行優(yōu)化。①在試驗(yàn)前的資料查詢中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的pH值會(huì)對(duì)七種組分的分離效果產(chǎn)生影響，pH值大于4時(shí)有些組分會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，pH值在2.0~3.0時(shí)7種組分可以較好的分離，但是流動(dòng)相pH值在2.0左右時(shí)對(duì)色譜柱的損傷較大，所以流動(dòng)相的pH值的考察選擇在2.5~3.0。②為了解決鹽酸美滿霉素出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象，筆者對(duì)草酸溶液的濃度進(jìn)行了考察。③為了解決鹽酸多西環(huán)素與氯霉素的色譜峰的分離度不能達(dá)到1.5的情況，筆者對(duì)流動(dòng)相的比例和流速進(jìn)行了考察。最后發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為0.003 mol/L草酸溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）∶乙腈∶甲醇（70∶10∶20），流速為0.8 mL/min時(shí)色譜峰的峰形以及分離度都較好；④參考文獻(xiàn)中多采用了梯度洗脫的方式，但是梯度洗脫液相色譜儀至少需要配置二元泵且梯度洗脫在試驗(yàn)過(guò)程中容易出現(xiàn)基線漂移的情況，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不采用梯度洗脫的方式也能分離檢測(cè)7種待測(cè)組分，所以還是選擇固定流動(dòng)相比例來(lái)檢測(cè)。

4.3 20批樣品中添加7種抗生素的情況分析

20批樣品中購(gòu)于正規(guī)化妝品連鎖店的10批樣品均未檢出其中組分，購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)（包括直播帶貨）的10批樣品有一批樣品檢出了甲硝唑，含量為546.46 mg/kg且該批樣品來(lái)源于直播帶貨平臺(tái)，存在未標(biāo)注生產(chǎn)許可證號(hào)且標(biāo)注有禁止用語(yǔ)（醫(yī)療術(shù)語(yǔ)）的情況。現(xiàn)在不僅有淘寶、京東等電商平臺(tái)，抖音、快手、拼多多等直播帶貨平臺(tái)也日漸火爆，但是直播帶貨平臺(tái)商品的質(zhì)量較差，在日后的產(chǎn)品監(jiān)督檢測(cè)中應(yīng)加大其產(chǎn)品的監(jiān)督強(qiáng)度及頻次。

5 結(jié)論

該試驗(yàn)方法對(duì)鹽酸美滿霉素等七種組分現(xiàn)行檢測(cè)規(guī)范的檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，從樣品的前處理提取液濃度和比例、流動(dòng)相pH值、流動(dòng)相比例和流速、是否采取梯度洗脫等方面進(jìn)行了試驗(yàn)條件的篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)化后的試驗(yàn)方法前處理簡(jiǎn)潔、靈敏度好、回收率高，能快速地對(duì)鹽酸美滿霉素等七種組分進(jìn)行準(zhǔn)確地分離和定量，可對(duì)膏霜類祛痘抗粉刺化妝品中的7種抗生素的含量進(jìn)行測(cè)定。