任妍妍，彭 巍，劉 賢，趙楊楊，張子敬，付長(zhǎng)其，張 君，田全召，王二耀，雷初朝，黃永震*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海大學(xué)，西寧 810016；3.河南省畜牧總站，鄭州 450008；4.河南省鼎元種牛育種有限公司，鄭州 450000；5.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002)

在過(guò)去20年，人類(lèi)、小鼠、牛、羊等先后完成了基因組圖譜繪制，我們對(duì)核苷酸編碼的一維DNA分子有了深入了解，但哺乳動(dòng)物的DNA線性長(zhǎng)度可長(zhǎng)達(dá)2 m，它是如何存在僅有10 nm左右的細(xì)胞核內(nèi)的呢?早期的二維線性基因組不能解釋基因的調(diào)控元件是如何與距離它們幾萬(wàn)甚至十幾萬(wàn)個(gè)核苷酸的靶基因相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，染色體的多級(jí)高度折疊和纏繞是以核小體為基本單位進(jìn)行的，形成動(dòng)態(tài)的復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)，在僅有10 nm左右的細(xì)胞核中折疊，其在空間中的有序折疊，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著重要作用。許多研究表明，原本線性距離非常遠(yuǎn)的調(diào)控因子可以通過(guò)染色質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)達(dá)到空間上的近距離調(diào)控。細(xì)胞核中染色質(zhì)的存在位置不是無(wú)序的，而是受精密的調(diào)控，它們之間有千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，并且其存在方式和位置都對(duì)基因表達(dá)調(diào)控起著重要的作用。隨著染色質(zhì)捕獲技術(shù)的發(fā)展，染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)逐漸被揭示，按照結(jié)構(gòu)單元大小和分辨率被分為4個(gè)層級(jí)：染色質(zhì)疆域(chromosome territories，CTs)、染色質(zhì)區(qū)室(chromatin compartments)、拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域(topologically associated domains，TADs)、染色質(zhì)環(huán)(chromatin loops，CLs)。對(duì)三維基因組的研究能更好地探究基因間的互作機(jī)制以及染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的作用。

1 三維基因組的結(jié)構(gòu)單元

1.1 染色質(zhì)疆域

細(xì)胞核內(nèi)的每條染色質(zhì)相對(duì)獨(dú)立，不同染色質(zhì)僅在邊界有重疊，而且能與其他染色質(zhì)發(fā)生相互作用的區(qū)域稱為染色質(zhì)疆域(chromosome territories，CTs)。染色質(zhì)疆域是最早被發(fā)現(xiàn)的基因組空間結(jié)構(gòu)，早期細(xì)胞學(xué)家通過(guò)顯微鏡和熒光原位雜交技術(shù)對(duì)大量動(dòng)、植物，微生物細(xì)胞進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)并非隨機(jī)分布在細(xì)胞核中，而是具有一定的結(jié)構(gòu)和規(guī)律，不同染色質(zhì)占據(jù)不同的空間[1]。CT在細(xì)胞核內(nèi)的分布與染色質(zhì)大小、基因密度、轉(zhuǎn)錄活性等有關(guān)。基因密度高，轉(zhuǎn)錄相對(duì)活躍的染色質(zhì)在細(xì)胞核中通常位于更中心的位置；而低基因密度的染色質(zhì)通?？拷?xì)胞核的邊緣[2]。在同一CT中，基因富集和轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域的DNA片段更頻繁地定位于CT的邊界處[3]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，不同的染色質(zhì)疆域只在其邊界處發(fā)生重疊[4]，且重疊的染色體之間存在相互作用，使得與遺傳疾病相關(guān)的染色體間易位成為可能。

1.2 染色質(zhì)區(qū)室

2009年，Lieberman Aiden等[5]首次利用Hi-C技術(shù)揭示了染色體內(nèi)部基因組區(qū)域之間具有明顯的相互作用，并將基因組區(qū)分為兩個(gè)相對(duì)分隔的A區(qū)室和B區(qū)室。A/B區(qū)室代表開(kāi)放和關(guān)閉兩種不同狀態(tài)的染色體區(qū)域(chromatin compartments)，A Compartment是轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，與基因富集區(qū)域、常染色質(zhì)和轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域相關(guān)，表觀遺傳修飾標(biāo)記更為富集，如DNaseⅠ高敏位點(diǎn)和組蛋白H3K4me3等；B Compartment與基因沙漠、異染色質(zhì)和轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域相關(guān)，富集更多的抑制性組蛋白標(biāo)記，如H3K27me3[6]。染色質(zhì)間的相互作用更多發(fā)生在同一個(gè)區(qū)室內(nèi)的位點(diǎn)之間。在細(xì)胞核中，染色質(zhì)的空間分布不是隨機(jī)的，通常與細(xì)胞核結(jié)構(gòu)有關(guān)，A區(qū)室通常位于細(xì)胞核內(nèi)部，B區(qū)室主要定位于周?chē)暮死w層和核仁附近。最近有研究提出，通過(guò)分子模擬A/B區(qū)室的形成是經(jīng)由染色質(zhì)片段相分離過(guò)程：當(dāng)一段染色質(zhì)結(jié)合在核纖層或其它核小體上時(shí)，與之相同狀態(tài)的其他染色質(zhì)也會(huì)隨之結(jié)合進(jìn)而引發(fā)相分離，形成A/B區(qū)室[7]。有研究發(fā)現(xiàn)[8]，在細(xì)胞分化成熟的過(guò)程中往往伴隨部分染色質(zhì)區(qū)段的A/B區(qū)室轉(zhuǎn)變。在T細(xì)胞分化成熟過(guò)程中，其基因組A/B分區(qū)持續(xù)發(fā)生轉(zhuǎn)變，其中57.6%由B區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锳區(qū)室，37.4%由A區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锽區(qū)室，僅4.9%的區(qū)域在A/B分區(qū)上的存在反復(fù)。

1.3 拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域

2012年5月，Job Dekker團(tuán)隊(duì)[9]在小鼠失活的X染色體中心發(fā)現(xiàn)了大小介于200 kb～1 Mb之間的一系列離散的拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域(topologically associated domains，TADs)。當(dāng)Hi-C互作圖譜的染色質(zhì)分辨率提高到40 kb或更高時(shí)，在互作熱圖上高度自我相關(guān)的染色質(zhì)區(qū)域表現(xiàn)為大小不一，具有明顯間隔的“三角形”[10]，每條染色體均由多個(gè)結(jié)構(gòu)單元組成，即拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域(TAD)，“三角形”的邊界被稱為T(mén)AD邊界。TADs是細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元，在核空間中形成獨(dú)立的結(jié)構(gòu)模塊，是一個(gè)高度自關(guān)聯(lián)的不間斷區(qū)域，其內(nèi)部染色質(zhì)相互作用強(qiáng)，相鄰區(qū)域之間有明顯的邊界且相互作用弱[10]。同一個(gè)TAD內(nèi)的基因通常處于相似的活性或非活性狀態(tài)?；蚪M活性與非活性狀態(tài)的改變總是發(fā)生在TAD邊界附近，這說(shuō)明TAD邊界處可能具有隔離功能。Dixon等[11]在人類(lèi)和小鼠4個(gè)細(xì)胞系上利用Hi-c技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)TAD位置及其邊界在不同細(xì)胞類(lèi)型間及人和小鼠間均高度保守，即使在細(xì)胞分化過(guò)程中也表現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，該研究結(jié)果支持了TAD邊界及其隔離功能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有重要意義。TAD邊界處富含CTCF結(jié)合位點(diǎn)、看家基因、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和一些短散在重復(fù)序列。黏連蛋白復(fù)合體和阻遏子CTCF是TAD邊界處的主要結(jié)合蛋白，兩者對(duì)TADs的定位和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)揮了重要作用[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，TAD邊界與DNA復(fù)制域邊界存在大量重疊，暗示TADs可能與DNA復(fù)制有關(guān)。2014年，Pope等[13]在人類(lèi)和小鼠細(xì)胞系中研究了TADs與DNA復(fù)制的關(guān)系，得出結(jié)論“TADs是DNA復(fù)制時(shí)序調(diào)控基本單元”，DNA復(fù)制時(shí)序往往與染色質(zhì)狀態(tài)密切相關(guān)，處于活躍狀態(tài)的染色質(zhì)在細(xì)胞分裂階段會(huì)更早地被復(fù)制，而抑制狀態(tài)的染色質(zhì)則會(huì)被較晚地復(fù)制?？偟膩?lái)說(shuō)，TAD作為染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)基本功能單位，占基因組結(jié)構(gòu)的絕大部分，廣泛存在于不同的細(xì)胞類(lèi)型和不同的物種中，與細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控、疾病發(fā)生和機(jī)體免疫等有著密切關(guān)系。

1.4 染色質(zhì)環(huán)

在1 kb的分辨率下，Rao等[14]發(fā)現(xiàn)了直接調(diào)控基因表達(dá)最精細(xì)的結(jié)構(gòu)和功能單元：染色質(zhì)環(huán)(chromatin loops，CLs)，這是一種由簡(jiǎn)單染色質(zhì)纖維折疊而形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)環(huán)是可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)，它是由TAD內(nèi)的遠(yuǎn)端調(diào)控元件通過(guò)染色質(zhì)三維立體折疊或碰撞使與其靶基因在空間上可以相互接近從而調(diào)控基因。染色質(zhì)環(huán)大小通常在數(shù)百kb，遠(yuǎn)小于TAD，在Hi-C互作圖譜上顯示為更加細(xì)小的互作峰[15]。染色質(zhì)環(huán)的兩端通常與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等基因調(diào)控元件相連，這些基因調(diào)控元件對(duì)不同細(xì)胞的基因表達(dá)量有很大影響，且形成染色質(zhì)環(huán)的基因表達(dá)量也高于沒(méi)有形成染色質(zhì)環(huán)的基因表達(dá)量，暗示染色質(zhì)環(huán)與基因激活和基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)[16]。染色質(zhì)環(huán)之間沒(méi)有重疊，大多數(shù)的CL中都存在CTCF和黏連蛋白亞基，CTCF和黏連蛋白共同參與了染色質(zhì)環(huán)的形成。早期有研究，將CTCF或cohesin敲除后會(huì)抑制染色質(zhì)環(huán)的形成，部分基因的表達(dá)量也發(fā)生變化，缺少兩者中的任意一個(gè)都會(huì)破壞染色質(zhì)環(huán)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證實(shí)了染色質(zhì)環(huán)與基因激活和基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)[17]。目前，染色質(zhì)環(huán)形成機(jī)制尚不清楚，早期生物學(xué)家利用CTCF結(jié)合位點(diǎn)信息預(yù)測(cè)基因組的折疊方式，并提出“環(huán)擠壓模型”解釋染色質(zhì)折疊成環(huán)機(jī)制[18]。染色質(zhì)環(huán)在不同物種、不同細(xì)胞系間具有相對(duì)的特異性和保守性，通過(guò)對(duì)染色質(zhì)環(huán)的深入研究，可以初步了解染色質(zhì)更深層次的三維結(jié)構(gòu)及其與基因調(diào)控表達(dá)的關(guān)系。

2 三維基因組分析方法

2.1 熒光原位雜交技術(shù)

FISH即染色體熒光原位雜交(flourescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是通過(guò)將熒光素標(biāo)記的DNA探針與樣本細(xì)胞核內(nèi)的DNA目標(biāo)序列雜交，從而獲得細(xì)胞核內(nèi)染色體或基因狀態(tài)的信息[19]。早期生物學(xué)家以顯微鏡和熒光原位雜交技術(shù)對(duì)染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，可以進(jìn)行基因定位的單細(xì)胞分析。由于技術(shù)方法的限制，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)只能在低分辨率下解讀，而核組織的一般原則或個(gè)別基因的特征無(wú)法被高效且清晰地觀察到[20]。目前此方法應(yīng)用較少，隨著染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)的發(fā)展，才深入了解了基因組內(nèi)染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息。

2.2 染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)(3C)

2002年Job Dekker等[21]開(kāi)發(fā)了染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(capturing chromosome conformation，3C)新技術(shù)并應(yīng)用于酵母染色質(zhì)互作觀察。3C技術(shù)通過(guò)生物學(xué)分析可以將特定位點(diǎn)之間的三維互作信息反映到二維互作圖譜上，從而確定特定DNA位點(diǎn)與相鄰位點(diǎn)的互作情況[22]。3C技術(shù)的基本操作步驟為：(1)分離細(xì)胞，利用甲醛固定樣本，使細(xì)胞發(fā)生原位交聯(lián)，此步可使空間上相鄰的染色質(zhì)片段發(fā)生共價(jià)連接；(2)可利用限制性內(nèi)切酶或超聲波將DNA分子切割成特定大小的片段，該步驟可消化DNA—蛋白質(zhì)復(fù)合物；(3)在極低DNA濃度條件下利用DNA連接酶將空間上接近的DNA片段優(yōu)先發(fā)生連接，此步可降低DNA片段之間發(fā)生隨機(jī)連接；(4)提取處理過(guò)的DNA，最后設(shè)計(jì)兩個(gè)特定基因位點(diǎn)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)新連接片段的相對(duì)豐度，則可以判斷這兩個(gè)特定位點(diǎn)是否存在遠(yuǎn)距互作[23]。

3C技術(shù)只能驗(yàn)證一個(gè)位點(diǎn)與另一個(gè)位點(diǎn)之間的相互作用，而且每驗(yàn)證一對(duì)位點(diǎn)的相互作用就需要設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，操作復(fù)雜，在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性[24]。為了解決3C技術(shù)中存在的不足，科研工作者們先后又發(fā)明了基于3C技術(shù)的各種衍生技術(shù)，例如4C(circularized chromosome conformation capture，4C)，5C(carbon-copy chromosome conformation capture，5C)，Hi-C(High-throughput chromosome conformation capture，Hi-C)，ChIA-PET，ATAC-seq等技術(shù)[25]。其中4C技術(shù)可以檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)的互作；5C技術(shù)可同時(shí)測(cè)定多個(gè)位點(diǎn)的相互作用；Hi-C能夠檢測(cè)所有目標(biāo)基因組位點(diǎn)的所有位點(diǎn)的相互作用；ChIA-PET技術(shù)類(lèi)似于Hi-C技術(shù)，改善了測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的噪音；ATAC-seq能檢測(cè)開(kāi)放區(qū)域染色質(zhì)的DNA序列。3C及其衍生技術(shù)的快速發(fā)展，極大地促進(jìn)了其在不同領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

2.3 Hi-C

在3C衍生技術(shù)中，Hi-C技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，可以一次性檢測(cè)所有染色質(zhì)片段互作信息。2009年Job Dekker等[26]發(fā)明了Hi-C技術(shù)，它結(jié)合了染色體構(gòu)象捕獲和高通量測(cè)序技術(shù)，它是以整個(gè)細(xì)胞核為研究對(duì)象，利用新一代測(cè)序技術(shù)與分子標(biāo)記，研究DNA在整個(gè)染色質(zhì)中的空間位置，通過(guò)捕獲全部DNA在染色質(zhì)內(nèi)的互作模式，從而得到高分辨率的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息。Hi-C操作技術(shù)與3C技術(shù)有所不同，主要步驟為：(1)加入甲醛以固化基因組中參與染色質(zhì)互作的蛋白質(zhì)；(2)用限制性內(nèi)切酶切割固定后的染色質(zhì)。限制性內(nèi)切酶有兩種：6 bp和4 bp的限制性內(nèi)切酶，后者的分辨率更高；(3)得到具有平末端和粘性末端的片段，修復(fù)末端并添加生物素標(biāo)記；(4)使用T4 DNA連接酶連接互作片段，將未互作的DNA片段去生物素，得到交聯(lián)片段；(5)利用超聲波或其他方法再次打斷片段；(6)用鏈霉親和素磁珠將富集生物素標(biāo)記的片段進(jìn)行捕獲，制作文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序，最終獲得高通量染色質(zhì)互作信息[27]。

Hi-C技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)防、輔助動(dòng)物基因組裝、挖掘基因調(diào)控組件、識(shí)別三位基因組結(jié)構(gòu)變化等研究工作中。雖然Hi-C技術(shù)可以提供全基因組所有染色質(zhì)位點(diǎn)之間的互作信息，但Hi-C技術(shù)中也存在很多問(wèn)題，其中包括：實(shí)驗(yàn)成本高、測(cè)序量大、測(cè)序過(guò)程中噪音大、過(guò)程繁瑣、周期長(zhǎng)等缺陷[28]。為了解決這些問(wèn)題，科研工作者們開(kāi)發(fā)了一系列Hi-C優(yōu)化技術(shù)，如原位Hi-C(in situ Hi-C)和基于酶切酶連的Hi-C(Digestion-Ligation-Only Hi-C，DLO Hi-C)等技術(shù)。原位Hi-C技術(shù)通過(guò)在細(xì)胞核原位完成交聯(lián)、酶切、連接步驟，同時(shí)縮短了實(shí)驗(yàn)周期，減少了假陽(yáng)性結(jié)果。在DLO Hi-C技術(shù)中，生物素標(biāo)記這一步驟被去除，僅需2輪簡(jiǎn)單的酶切酶連反應(yīng)就可以構(gòu)建高質(zhì)量的DLO Hi-C測(cè)序文庫(kù)，其主要優(yōu)點(diǎn)是縮短試驗(yàn)時(shí)間、降低了試驗(yàn)成本和測(cè)序成本、噪音、數(shù)據(jù)提取以及后期分析的難度，可以獲得更有效的交互數(shù)據(jù)[28]。

2.4 CRISPR研究三維基因組的技術(shù)方法

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas)是細(xì)菌和古菌在面對(duì)病毒入侵時(shí)出現(xiàn)的原核生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[29-30]。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，細(xì)菌會(huì)啟動(dòng)自身的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，迅速獲取病毒基因的序列，然后整合到自己基因組內(nèi)的一個(gè)特定位點(diǎn)，形成CRISPR重復(fù)—間隔基因座，從而獲取對(duì)病毒的抗性，當(dāng)外源DNA再次入侵時(shí)，CRISPR重復(fù)—間隔基因座便會(huì)轉(zhuǎn)錄并加工為crRNA(CRISPR RNA)，并引導(dǎo)DNA核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白到達(dá)病毒基因的位置，執(zhí)行切割功能，從而破壞病毒基因。CRISPR/Cas系統(tǒng)的效應(yīng)酶不止Cas9蛋白，Cas蛋白家族有很多類(lèi)型的Cas酶，包括Cas9、Cas13、Cas12等[31]。通過(guò)CRISPR系統(tǒng)不僅能夠切割病毒的基因，還能夠被設(shè)計(jì)成特異地刪除與3D基因組結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因組片段，進(jìn)而研究由此引起的基因表達(dá)改變，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)可對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，該技術(shù)可以用于制作細(xì)胞或動(dòng)物模型的基因組調(diào)控元件的插入、刪除、反轉(zhuǎn)，并且可以用來(lái)研究三維基因組調(diào)控生命過(guò)程的機(jī)制，以及腫瘤、神經(jīng)退行性病變等各種疾病的治療中[32]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在三維基因組中的應(yīng)用主要依賴于能夠特異性結(jié)合基因的CRISPR/Cas序列，利用這一特性，可將修飾或未修飾的Cas9蛋白招募到特定的基因組位點(diǎn)上，使活細(xì)胞的特定染色體片段的時(shí)空動(dòng)態(tài)可視化，對(duì)基因組進(jìn)行切割和功能改造[33]。三維基因組中存在大量的染色質(zhì)重排，可以利用DNA大片段編輯技術(shù)進(jìn)行模擬，包括DNA片段刪除、重復(fù)、移位、反轉(zhuǎn)等[34]。若將CTCF 區(qū)域或者染色質(zhì)環(huán)的邊界區(qū)域設(shè)計(jì)為基因組大片段刪除的對(duì)象，就可以通過(guò)刪除這些區(qū)域破壞3D基因組的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而研究這些區(qū)域?qū)τ诨虮磉_(dá)的影響和功能。染色質(zhì)架構(gòu)蛋白CTCF的結(jié)合位點(diǎn)被CRISPR/Cas9雙切系統(tǒng)進(jìn)行反轉(zhuǎn)、插入或敲除，其研究結(jié)果都表明了CTCF對(duì)于維持細(xì)胞三維基因組架構(gòu)和動(dòng)態(tài)調(diào)控都具有重要作用[32，35]。有研究[36]利用DNA片段編輯技術(shù)將基因組部分進(jìn)行刪除與反轉(zhuǎn)，發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制時(shí)間發(fā)生了變化，說(shuō)明這些片段可能包含一些調(diào)控DNA復(fù)制時(shí)間時(shí)空特性的重要元件。單獨(dú)刪除與共同刪除這些元件對(duì)DNA復(fù)制的影響不同，說(shuō)明這些元件之間在發(fā)揮作用時(shí)可能存在相互依賴性[31]。Hi-C結(jié)果也表明這些元件的刪除會(huì)影響基因組區(qū)室劃分以及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域的強(qiáng)度。將基因組位點(diǎn)在三維空間直接可視化，能夠幫助理解基因組的空間架構(gòu)以及與基因表達(dá)調(diào)控等生命活動(dòng)的關(guān)系[31]。該方法是利用CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合基因組的序列特異性，失活的dCas9(nuclease-deactivated Cas9，D10A和H841A)熒光蛋白嵌合體可以被 sgRNA招募到基因組的特定位點(diǎn)，從而使活細(xì)胞的特定染色體片段的時(shí)空動(dòng)態(tài)可視化[33]。dCas9/sgRNA復(fù)合體的穩(wěn)定性以及dCas9蛋白結(jié)合DNA的高親和性使得該方法可以被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞三維基因組特定位點(diǎn)標(biāo)記[37]。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，相信基因組3D結(jié)構(gòu)會(huì)被揭示得更加清楚，從而實(shí)現(xiàn)深入研究染色質(zhì)空間構(gòu)象、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)機(jī)制、基因表達(dá)機(jī)制等問(wèn)題。

3 三維基因組學(xué)在家畜方面的研究進(jìn)展

染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)是重要的表觀遺傳因素，與基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育及疾病等密切相關(guān)[38]。在動(dòng)物育種中，探索遠(yuǎn)距離基因互作、非編碼DNA調(diào)控元件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，構(gòu)建動(dòng)物三維轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探索研究三維基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)在動(dòng)物科學(xué)上的應(yīng)用，揭示影響國(guó)內(nèi)外畜禽品種生長(zhǎng)速度、瘦肉沉積率[39]、產(chǎn)肉能力[40]、繁殖等重要經(jīng)濟(jì)性狀形成的新機(jī)制。

3.1 在畜禽中的研究

在國(guó)內(nèi)，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院已完成秦川牛肌肉基因組三維結(jié)構(gòu)及其對(duì)肌肉發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[6]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎牛和成年牛肌肉的loop結(jié)構(gòu)存在大量差異，包含447個(gè)增強(qiáng)子，其中與基因啟動(dòng)子成環(huán)的增強(qiáng)子有240個(gè)；構(gòu)建了牛肌肉基因組調(diào)控元件互作圖譜，在共計(jì)4716對(duì)啟動(dòng)子—增強(qiáng)子互作中有142個(gè)肌肉發(fā)育相關(guān)基因受到303個(gè)增強(qiáng)子調(diào)控，這些結(jié)果為肌肉發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制分析提供了數(shù)據(jù)支持。對(duì)這些基因的相關(guān)研究能夠有效避免如世代間隔時(shí)間長(zhǎng)，改良效率低、優(yōu)良種質(zhì)資源浪費(fèi)等現(xiàn)如今育種工作所面臨的問(wèn)題[41]。

豬是重要的經(jīng)濟(jì)家畜，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)是重要的表觀遺傳因素，與基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育和疾病等密切相關(guān)。然而豬染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)仍是一個(gè)新的探索領(lǐng)域[42]。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院王彥芳團(tuán)隊(duì)等[43]構(gòu)建了豬體細(xì)胞染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖譜，追蹤豬在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中染色質(zhì)空間構(gòu)象重編程過(guò)程。這項(xiàng)研究表明，在胚胎成功發(fā)育過(guò)程中，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重編程的速率可能起著關(guān)鍵作用。該研究成果為豬染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)化研究提供了理論依據(jù)，并為提高豬的輔助生殖效率提供了參考價(jià)值。西北農(nóng)林科技大學(xué)曾文先教授團(tuán)隊(duì)[44]系統(tǒng)研究了豬精原干細(xì)胞和分化精原細(xì)胞的染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步闡明了精原干細(xì)胞分化過(guò)程中的高級(jí)染色質(zhì)動(dòng)態(tài)變化。研究首次明確了精原干細(xì)胞分化過(guò)程中的三維基因組空間結(jié)構(gòu)變化及其對(duì)基因表達(dá)的重要調(diào)控作用，對(duì)揭示精原干細(xì)胞分化的分子機(jī)制具有重要意義，極大地?cái)U(kuò)展了人們對(duì)豬精原干細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程的認(rèn)識(shí)。四川農(nóng)大動(dòng)科學(xué)院豬遺傳育種團(tuán)隊(duì)[45]通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，從單根肌纖維分辨率的水平揭示了3種不同肌纖維亞型的在能量代謝和脂質(zhì)沉積上的差異。并且在現(xiàn)有豬參考基因組的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充完善注釋了大量調(diào)控性轉(zhuǎn)錄本；并采用Hi-C技術(shù)重構(gòu)了豬脂肪組織的染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)。該研究對(duì)豬肉質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制進(jìn)行了深入解析，并為以后開(kāi)展分子育種提供了重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽團(tuán)隊(duì)劉小軍教授[46]通過(guò)比較地方品種盧氏雞和快大型AA肉雞在三維基因組結(jié)構(gòu)上的差異，首次揭示了染色質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域(TAD)變化對(duì)雞肌纖維發(fā)育和肌內(nèi)脂肪(IMF)沉積的影響，該研究加深了我們對(duì)肌肉發(fā)育和脂質(zhì)積累過(guò)程中染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)的理解，而且還揭示了雞肌肉發(fā)育和IMF沉積的表觀遺傳調(diào)控新機(jī)制。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李地艷教授團(tuán)隊(duì)[47]對(duì)雞不同卵泡發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的顆粒細(xì)胞進(jìn)行了研究，利用多組學(xué)聯(lián)合分折對(duì)卵泡發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵階段染色質(zhì)構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行深入解析。結(jié)果表明，作為染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白的CTCF在雞的三維基因組結(jié)構(gòu)形成中起到了重要作用。這一研究結(jié)果為家禽分子育種過(guò)程中提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、發(fā)育能力及其受精后種蛋質(zhì)量提供了重要的理論依據(jù)，為高繁殖性能新雞種的選育及繁殖性狀研究提供了新思路。有研究人員解析北京鴨的三維基因組空間構(gòu)象[48]通過(guò)Hi-C數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)IGF2BP1基因由于遠(yuǎn)距離增強(qiáng)子的自然突變，導(dǎo)致在胚胎期起生長(zhǎng)促進(jìn)作用的IGF2BP1基因在北京鴨出殼后仍不斷表達(dá)，提高了飼料利用率從而體格變大。該研究結(jié)果為鴨子的經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良提供了理論依據(jù)。

4 小結(jié)和展望

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，在現(xiàn)代生物育種中，人類(lèi)已經(jīng)積累了大量的數(shù)據(jù)和信息在生物大分子結(jié)構(gòu)和功能上，例如核酸和蛋白質(zhì)，現(xiàn)代動(dòng)物育種技術(shù)還結(jié)合了遺傳學(xué)理論、生物技術(shù)、計(jì)算機(jī)、系統(tǒng)工程等育種方法，實(shí)現(xiàn)分子育種，從遺傳上改良種質(zhì)并使其達(dá)到最大的經(jīng)濟(jì)效益，提高選種選配的效果，提高育種的準(zhǔn)確性。

三維基因組學(xué)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。本文主要介紹了其在動(dòng)物科學(xué)方面的研究進(jìn)展，DNA的三維結(jié)構(gòu)極大地影響了生物復(fù)雜性狀的形成，例如畜禽上的肉用性狀、毛色性狀、體型、對(duì)飼料的利用率等。

我國(guó)目前存在引入大量外來(lái)品種，導(dǎo)致本地品種在市場(chǎng)中的占比很小的問(wèn)題，許多畜禽品種依賴進(jìn)口，種業(yè)內(nèi)在的核心技術(shù)創(chuàng)新不足，國(guó)內(nèi)大量種質(zhì)資源僅有很少一部分進(jìn)行研究，真正有用的基因類(lèi)型還沒(méi)有被發(fā)掘，地方特色種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)不足，種質(zhì)資源消失的風(fēng)險(xiǎn)加劇，種質(zhì)資源的發(fā)掘保護(hù)要和種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)同時(shí)進(jìn)行，先要有足夠的種質(zhì)資源達(dá)到量變，以此為基礎(chǔ)，才能引發(fā)研發(fā)創(chuàng)新的質(zhì)變。

三維基因組學(xué)是基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)前沿領(lǐng)域之一，聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組、表觀組、代謝組等多組學(xué)的分析，揭示染色質(zhì)構(gòu)象與具體基因功能的關(guān)系。三維基因組學(xué)研究基因組各種元件的功能及其調(diào)控關(guān)系，可以進(jìn)一步識(shí)別和分析關(guān)鍵突變及其機(jī)制，是高技術(shù)與高維數(shù)據(jù)分析驅(qū)動(dòng)的新組學(xué)研究，其可以將目前已知的二維平面數(shù)據(jù)立體化起來(lái)，使得系統(tǒng)生物學(xué)有了更深層次的探究。因此對(duì)我國(guó)重要家畜的三維基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析，不但為精準(zhǔn)育種和重要經(jīng)濟(jì)性狀改良提供理論依據(jù)，也為我國(guó)農(nóng)業(yè)科技的持續(xù)創(chuàng)新提供有力的基礎(chǔ)支撐。