杜 鵑，吳 迪，吳惠明，周德剛，巴洪宇，史 記，范君文，傅彩霞，沈光年

（北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100026）

為全面了解獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測能力和動(dòng)物疫情監(jiān)測預(yù)警水平，促進(jìn)北京市整體動(dòng)物疫病檢測能力的提升，按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)一要求，2019—2021 年，北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心組織全市獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室開展了檢測能力比對(duì)工作。比對(duì)施行統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)、檢測時(shí)間和試劑樣品，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)收回檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比對(duì)結(jié)果真實(shí)反映了北京市各區(qū)基層實(shí)驗(yàn)室的檢測能力水平，這對(duì)促進(jìn)基層實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)檢測能力建設(shè)，提高質(zhì)量控制水平意義重大。

1 材料與方法

1.1 比對(duì)方法

2019—2021 年北京市獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對(duì)，共設(shè)置了檢測項(xiàng)目14 個(gè)（表1）。每個(gè)比對(duì)項(xiàng)目設(shè)置5～6 個(gè)檢測盲樣。全市配有實(shí)驗(yàn)室的12 個(gè)區(qū)全部參加了本次比對(duì)，包括順義、平谷、房山、門頭溝、昌平、密云、豐臺(tái)、懷柔、大興、朝陽、通州、延慶，其中有2 個(gè)區(qū)實(shí)驗(yàn)室不具備分子生物學(xué)檢測能力，不參加分子生物學(xué)檢測項(xiàng)目，2020、2021 年分別單獨(dú)為其設(shè)置了1 項(xiàng)血清學(xué)檢測項(xiàng)目，保證每個(gè)實(shí)驗(yàn)室每年參加3～4 個(gè)檢測項(xiàng)目。

表1 2019—2021 年北京市獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對(duì)項(xiàng)目 單位：個(gè)

1.2 試驗(yàn)項(xiàng)目和試劑

2019—2021 年不同比對(duì)項(xiàng)目選取的方法、標(biāo)準(zhǔn)及試劑見表2，個(gè)別重復(fù)的比對(duì)項(xiàng)目采用的方法、標(biāo)準(zhǔn)及試劑相同。

表2 比對(duì)項(xiàng)目的方法、標(biāo)準(zhǔn)和試劑

1.3 比對(duì)樣品制備

比對(duì)樣品由國家參考實(shí)驗(yàn)室或相應(yīng)試劑公司生產(chǎn)，由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心進(jìn)行測試、分裝和編號(hào)，并標(biāo)定樣品參考值，每份樣品量可保證足夠用于重復(fù)性檢測。

1.4 比對(duì)樣品保存和發(fā)放

比對(duì)所用檢測試劑由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心統(tǒng)一購入，按試劑盒要求條件存放。比對(duì)樣品制備完成后-20℃保存。由各區(qū)參與比對(duì)的實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定時(shí)間統(tǒng)一領(lǐng)取，放入裝有冰袋的保溫箱中4 h 內(nèi)送至比對(duì)實(shí)驗(yàn)室。

1.5 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

口蹄疫病毒O 型抗體檢測、H5 亞型禽流感病毒抗體試驗(yàn)、H7 亞型禽流感病毒抗體檢測評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：檢測值與參考值的偏差不超過1 個(gè)滴度，判為結(jié)果符合。

布魯氏菌抗體檢測、口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測、H7N9 亞型禽流感病毒檢測、豬瘟病毒抗體檢測、禽流感病毒通用型檢測、非洲豬瘟病毒檢測、小反芻獸疫病毒抗體檢測、禽白血病病毒p27 抗原檢測評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：陽性樣品的檢測結(jié)果應(yīng)為“陽性”，陰性樣品的檢測結(jié)果應(yīng)為“陰性”。

1.6 結(jié)果分析

各項(xiàng)目根據(jù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果分析。2019—2021 年北京市獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對(duì)共設(shè)置的14 個(gè)檢測項(xiàng)目中，除F-PCR 設(shè)置為定量試驗(yàn)外，其余項(xiàng)目均設(shè)置為定性試驗(yàn)，不再作進(jìn)一步的偏離程度分析。本研究僅對(duì)2019 年的H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RT-PCR），2020 年的禽流感病毒通用型檢測（熒光RT-PCR）、非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）和2021 年的非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR），按照《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》（CNAS-Gl002）中方法進(jìn)行能力統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算。以相對(duì)偏差（D）和Z 比分?jǐn)?shù)，分析各實(shí)驗(yàn)室檢測值和給定參考值的差異。計(jì)算公式：D=（檢測值-參考值）×100%/ 參考值；Z=（檢測值-參考值）/σ，其中σ表示能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值（預(yù)期值）設(shè)定為0.2×參考值。2019 年的H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RT-PCR）強(qiáng)陽性樣品H7、N9 的Ct 值參考值均為20，弱陽性樣品H7、N9 的Ct 值參考值均為30；2020 年的禽流感病毒通用型檢測（熒光RT-PCR）強(qiáng)陽性樣品Ct 值參考值為18，弱陽性樣品Ct 值參考值為24，非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）強(qiáng)陽性樣品Ct 值參考值為25，弱陽性樣品Ct 值參考值為31；2021 年的非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）強(qiáng)陽性樣品Ct 值參考值為28，弱陽性樣品Ct 值參考值為33。結(jié)果分析：｜Z｜≤2，表明“滿意”；2 ＜｜Z｜＜3，表明“有問題”，產(chǎn)生警戒信號(hào)，提醒實(shí)驗(yàn)室應(yīng)引起注意；｜Z｜≥3，表明“不滿意”，產(chǎn)生措施信號(hào)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分析原因，制定針對(duì)性整改措施。

2 結(jié)果

2019—2021 年共開展了14 個(gè)項(xiàng)目的比對(duì)。根據(jù)檢測結(jié)果評(píng)判規(guī)則，全市區(qū)級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中不同年份、不同比對(duì)項(xiàng)目的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表3。

表3 2019—2021 年北京市獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對(duì)結(jié)果

2.1 各年份實(shí)驗(yàn)室比對(duì)結(jié)果

按照不同年份統(tǒng)計(jì)，2019—2021 年各年份實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對(duì)結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)室全部符合率從2019 年的75.00%提至2021 年100%，樣品符合率從2019 年98.02%提高到2021 年100%。

表4 2019—2021 年各年份實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對(duì)結(jié)果

2.2 各實(shí)驗(yàn)室3 年比對(duì)結(jié)果

全市共有區(qū)級(jí)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室12 個(gè)，3 年全部參加實(shí)驗(yàn)室比對(duì)，參與率100%。按照結(jié)果全部符合的年數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（圖1）。

圖1 2019—2021 三年實(shí)驗(yàn)室全部符合率分布圖

2.3 各檢測技術(shù)類別比對(duì)結(jié)果

按檢測技術(shù)類別統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)室各技術(shù)類別檢測能力比對(duì)結(jié)果見表5。2019—2021 年開展的14個(gè)比對(duì)項(xiàng)目，涵蓋了血凝抑制試驗(yàn)（HI）、試管凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、F-PCR 4 個(gè)技術(shù)類別，HI 實(shí)驗(yàn)室符合率為100%，試管凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室符合率為100%，ELISA 實(shí)驗(yàn)室符合率83.33%，F(xiàn)-PCR 實(shí)驗(yàn)室符合率為70.00%。

表5 2019—2021 年各技術(shù)類別檢測能力比對(duì)結(jié)果

2.4 熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（F-PCR）比對(duì)結(jié)果

對(duì)2019 年的H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RT-PCR），2020 年的禽流感病毒通用型檢測（熒光RT-PCR）、非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）和2021 年的非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）結(jié)果Ct 值進(jìn)行差異分析表明，除2019 年H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RT-PCR）2 個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別有1 個(gè)弱陽性樣品未檢出，判定陰性，2020 年的禽流感病毒通用型檢測（熒光RT-PCR）1 個(gè)實(shí)驗(yàn)室1 個(gè)弱陽性樣品未檢出，判定陰性外，其他實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均未出現(xiàn)判定結(jié)果結(jié)論性錯(cuò)誤。除2019 年H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RT-PCR）1 個(gè)實(shí)驗(yàn)室強(qiáng)陽性樣品2 ≤｜Z｜≤3，表明“有問題”，其他實(shí)驗(yàn)室檢測樣品均為｜Z｜≤2，表明“滿意”。各實(shí)驗(yàn)室比對(duì)結(jié)果Ct 值的相對(duì)偏差與Z 比分?jǐn)?shù)見表6～9，Z比分?jǐn)?shù)情況見圖2～5。

圖2 2019 年H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RT-PCR）比對(duì)結(jié)果Z 比分?jǐn)?shù)

表6 2019 年H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RT-PCR）比對(duì)結(jié)果

表7 2020 年禽流感病毒通用型檢測（熒光RT-PCR）比對(duì)結(jié)果

圖3 2020 年禽流感病毒通用型檢測（熒光RT-PCR）比對(duì)結(jié)果Z 比分?jǐn)?shù)

圖4 2020 年非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）比對(duì)結(jié)果Z 比分?jǐn)?shù)

圖5 2021 年非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）比對(duì)結(jié)果Z 比分?jǐn)?shù)

3 討論

每年比對(duì)項(xiàng)目的設(shè)置，都結(jié)合國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃以及當(dāng)前動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)，盡量覆蓋ELISA、F-PCR 等獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室常用檢測技術(shù)類別。對(duì)實(shí)驗(yàn)室間檢測能力比對(duì)出現(xiàn)結(jié)果錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)室，由市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供技術(shù)支持，協(xié)助其發(fā)現(xiàn)問題，落實(shí)整改，并重新進(jìn)行比對(duì)復(fù)測，直至結(jié)果達(dá)標(biāo)，這對(duì)強(qiáng)化基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力具有很大幫助。

北京市近3 年區(qū)級(jí)實(shí)驗(yàn)室間檢測能力比對(duì)符合率逐年提高，各年度實(shí)驗(yàn)室符合率分別為75.00%、83.33%、100%，各年度樣品符合率分別為98.02%、99.21%、100%。說明通過每年的實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對(duì)，查找問題并整改落實(shí)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的檢測能力在逐漸進(jìn)步，特別是分子生物學(xué)檢測能力有了質(zhì)的突破，但是仍然有2（2/12）個(gè)實(shí)驗(yàn)室不具備分子生物學(xué)檢測能力，需要加強(qiáng)軟硬件建設(shè)。

近3 年沒有實(shí)驗(yàn)室重復(fù)出現(xiàn)錯(cuò)誤，全對(duì)及出現(xiàn)過1 次錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)室分別占比58.33%和41.67%，說明實(shí)驗(yàn)室檢測能力整體理想，但是穩(wěn)定性還有待提高，需要加強(qiáng)人員培訓(xùn)，進(jìn)一步提高準(zhǔn)確度。

從3 年試驗(yàn)時(shí)間比對(duì)覆蓋的檢測技術(shù)類別來看，HI、試管凝集作為常用檢測技術(shù)，各實(shí)驗(yàn)室操作比較熟練，符合率穩(wěn)定性比較好；ELISA 也是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室常用檢測技術(shù)，但是有競爭ELISA、液相阻斷ELISA 等眾多種類，所以ELISA 試驗(yàn)也是基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室常出問題的項(xiàng)目；而F-PCR 是近幾年在北京市各基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室剛剛普及的檢測技術(shù)，培訓(xùn)頻率高、強(qiáng)度大，也是進(jìn)步最為突出的檢測技術(shù)。

對(duì)F-PCR 比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步分析表明，除2019年H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RT-PCR）2個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別有1 個(gè)弱陽性樣品未檢出，判定陰性，2020 年的禽流感病毒通用型檢測（熒光RTPCR）1 個(gè)實(shí)驗(yàn)室1 個(gè)弱陽性樣品未檢出，判定陰性外，其他實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均未出現(xiàn)判定結(jié)果結(jié)論性錯(cuò)誤。2019 年H7N9 亞型禽流感病毒檢測（熒光RTPCR）1 個(gè)實(shí)驗(yàn)室強(qiáng)陽性樣品2 ≤｜Z｜≤3，表明“有問題”，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)室也是有弱陽性樣品未檢出的實(shí)驗(yàn)室，提示該實(shí)驗(yàn)室引起注意，查找原因加強(qiáng)培訓(xùn)，提升該項(xiàng)目檢測能力。其他實(shí)驗(yàn)室檢測樣品均為｜Z｜≤2，表明“滿意”，尤其是非洲豬瘟病毒檢測（熒光PCR）項(xiàng)目在北京市具備分子生物學(xué)檢測能力的10 個(gè)區(qū)級(jí)實(shí)驗(yàn)室中標(biāo)準(zhǔn)化程度高，一致性強(qiáng)。10 個(gè)實(shí)驗(yàn)室全部作為北京市2019 年第一批授權(quán)開展非洲豬瘟檢測的實(shí)驗(yàn)室，在近年的非洲豬瘟疫情監(jiān)測工作中發(fā)揮了重要作用。

此外，近3 年實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對(duì)中各實(shí)驗(yàn)室的原始記錄來看，原始記錄信息不完整、沒有可追溯性等問題突出。這些問題需要實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步強(qiáng)化管理，不斷提高實(shí)驗(yàn)室管理水平和檢測人員的技術(shù)水平，確保實(shí)驗(yàn)室檢測的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和規(guī)范性，為北京市動(dòng)物疫病的防控以及食品安全和公共衛(wèi)生安全的保障提供有力的技術(shù)支持。