于 勇，左家坤，王凱民，張 瑤，李思言，韓先干，孫學(xué)強(qiáng)

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，OIE 豬鏈球菌病參考實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 730070；3.南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇南京 210095；4.青島立見(jiàn)生物科技有限公司，山東青島 266144；5.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是導(dǎo)致多種動(dòng)物巴氏桿菌病的一種重要病原，屬于巴氏桿菌科，為革蘭氏陰性菌，有莢膜，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，不能形成芽孢，亞甲藍(lán)染色時(shí)呈典型雙極著色。與大部分巴氏桿菌種屬類似，多殺性巴氏桿菌通常是多種動(dòng)物和鳥(niǎo)類正?？谘饰⑸锶旱慕M成部分，但同時(shí)它也是一種條件性致病菌，與多種動(dòng)物呼吸道綜合征密切相關(guān)[1]。多殺性巴氏桿菌廣泛存在于世界各地，特別是澳大利亞、越南、加拿大和美國(guó)等國(guó)家流行嚴(yán)重[2-4]。該菌可導(dǎo)致一系列疾病暴發(fā)，如豬萎縮性鼻炎和禽霍亂等。我國(guó)學(xué)者對(duì)豬多殺性巴氏桿菌遺傳特征有一定研究[5]，但對(duì)禽多殺性巴氏桿菌研究較少。

禽多殺性巴氏桿菌是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一，能夠引起禽霍亂，導(dǎo)致家禽急性出血性敗血癥，死亡率高。此外，該病原菌通常與亞急性或慢性胸膜炎相關(guān)。研究[6]表明，禽多殺性巴氏桿菌具有遺傳多樣性，可以垂直和水平傳播，其中通過(guò)呼吸道和消化道傳播最常見(jiàn)，此外多殺性巴氏桿菌的種間傳播也被認(rèn)為可在某些條件下發(fā)生。

禽多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致禽類死亡的病程從幾小時(shí)到幾天不等，其致病性強(qiáng)弱與攜帶的各種毒力因子（VFs）有關(guān)[7-9]，包括莢膜、脂多糖（LPS）、黏附素、鐵調(diào)節(jié)系統(tǒng)、透明質(zhì)酸酶、唾液酸代謝相關(guān)酶等，這些VFs 能夠幫助多殺性巴氏桿菌入侵和抵御宿主的防御系統(tǒng)。研究[10-11]表明，莢膜血清型可能與巴氏桿菌病類型密切相關(guān)，根據(jù)莢膜抗原不同，多殺性巴氏桿菌主要分為5 個(gè)莢膜血清型（A、B、D、E 和F），分別由基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD調(diào)控。在我國(guó)，禽多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致的禽霍亂廣泛流行，但主要集中于南方地區(qū)，且以血清A 型為主。

目前，使用抗生素是預(yù)防和控制巴氏桿菌臨床感染的普遍方法[12]，但其耐藥性問(wèn)題不可忽視[13-14]。本試驗(yàn)對(duì)4 株臨床分離的雞源多殺性巴氏桿菌的莢膜血清型、毒力基因、耐藥性、生物被膜形成能力等進(jìn)行分析，以期為禽多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制研究和臨床防治提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來(lái)源 雞源多殺性巴氏桿菌Pm01 和Pm03 株，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)從某雞場(chǎng)病死雞肝臟中分離；1801 和1802 株，保種于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，從江蘇省某雞場(chǎng)病死雞肝臟中分離。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 DL 2 000 DNA Marker、2×HieffTMPCR Master mix 和瓊脂，均購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；BHI 培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)碧迪公司；M9 培養(yǎng)基，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；MgSO4和CaCl2，購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302-02），購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 藥敏紙片 甲氧嘧啶、恩諾沙星、阿奇霉素、克林霉素、大觀霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、利福平、復(fù)方新諾明、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢曲松、頭孢拉定和氨芐西林等20 種藥敏紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 1 日齡三黃雞200 只，購(gòu)自上海市某養(yǎng)雞場(chǎng)，按照相關(guān)動(dòng)物福利規(guī)定飼喂至21 日齡。

1.2 細(xì)菌基因組提取

將4 株多殺性巴氏桿菌凍存株復(fù)蘇后接種于BHI 培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；取1.0 mL 菌液至2.0 mL 離心管中，12 000 r/min離心2 min；棄掉上清，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取巴氏桿菌基因組，保存于-20 ℃，用于后續(xù)PCR 擴(kuò)增鑒定。

1.3 毒力基因和莢膜血清型PCR 鑒定

按照Townsend 等[15]方法，通過(guò)PCR 擴(kuò)增鑒定4 株多殺性巴氏桿菌的12 種毒力基因（toxA、pfhA、ptfA、nanH、nanB、exBDtonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87、ompH）[16]，及5 種莢膜血清型基因（A 型hyaD-hyaC、B 型bcbD、D 型dcbF、E 型ecbJ和F 型fcbD）[17]。根據(jù)NCBI 相關(guān)參考序列，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列和目的片段大小見(jiàn)表1，送上海桑尼生物科技有限公司合成。20 μL PCR反應(yīng)體系：2×HieffTMPCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，多殺性巴氏桿菌菌株DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，并用凝膠記錄系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.4 耐藥性試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2015 年標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定4 株多殺性巴氏桿菌的藥物敏感性。將4 株多殺性巴氏桿菌分別在BHI 瓊脂平板上劃線，挑取單個(gè)菌落接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期；用滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋菌液，使其渾濁度與0.5 的麥?zhǔn)媳葷峁芟喈?dāng)；將稀釋后的菌液分別均勻涂布于BHI 平板培養(yǎng)基表面，每塊平板培養(yǎng)基上貼5 個(gè)藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)16～18 h 后用游標(biāo)卡尺測(cè)定各種藥物抑菌圈直徑，每株菌均檢測(cè)20 種藥物敏感性。抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)，抑菌結(jié)果分為敏感、中度敏感（簡(jiǎn)稱“中敏”）和耐藥。

1.5 生物被膜形成能力測(cè)定

對(duì)劃線后的4 株多殺性巴氏桿菌分別挑取單個(gè)菌落接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期；吸取50 μL 菌液接種至5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，靜置培養(yǎng)至OD600nm=1.0，4 ℃離心收集菌體，使用BHI 基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗2 次；4 ℃離心收集菌體，分別用BHI、BHI+1%馬血清、BHI+1%葡萄糖培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整至OD600nm=0.3；分別吸取200 μL 菌液加至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，不同培養(yǎng)基重懸的每株菌重復(fù)6 孔，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h；小心棄去上清菌液，加入200 μL PBS 清洗3 遍，晾干后放入烘箱中烤20 min；加入0.1%結(jié)晶紫200 μL，37 ℃孵育染色15 min；棄去結(jié)晶紫，以PBS 清洗3 遍，自然晾干；加入95% 乙醇200 μL 溶解生物被膜，置于搖床（37 ℃、50 r/min）搖20 min，直至完全溶解，最后測(cè)定OD595nm。

1.6 半數(shù)致死劑量（LD50）測(cè)定

動(dòng)物試驗(yàn)根據(jù)國(guó)際生物醫(yī)學(xué)研究涉及動(dòng)物的指導(dǎo)原則（1985 年）進(jìn)行。將所購(gòu)的200 只三黃雞飼喂至21 日齡，隨機(jī)挑選健康、體質(zhì)量相近的136 只來(lái)測(cè)定多殺性巴氏桿菌株LD50。將4 菌株分別在BHI 平板上劃線，置于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單菌落置于BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期；以PBS 洗滌2 遍，再用PBS 將每株菌稀釋為2×104～2×101CFU/mL 4 個(gè)梯度（本試驗(yàn)前期已測(cè)定OD600nm=1.0 時(shí)，含菌量為3×108CFU/mL）；將136 只三黃雞隨機(jī)分成16 個(gè)試驗(yàn)組和1 個(gè)PBS 對(duì)照組（8 只/組），對(duì)不同試驗(yàn)組三黃雞分別肌肉注射4 種菌株不同梯度劑量的菌液0.5 mL，即每株菌的攻毒劑量梯度分別為104～101CFU，對(duì)照組三黃雞肌肉注射無(wú)菌PBS 0.5 mL；觀察記錄所有三黃雞7 d 內(nèi)的死亡數(shù)量，通過(guò)改良寇式法計(jì)算4 菌株的LD50。

2 結(jié)果

2.1 莢膜血清型鑒定

分別用多殺性巴氏桿菌5 種莢膜血清型引物，對(duì)4 株多殺性巴氏桿菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果（圖1）顯示，4 株多殺性巴氏桿菌均為莢膜血清A 型，使用引物hyaD-hyaC-F/R 均能擴(kuò)增出約l 000 bp 的片段，與預(yù)期條帶大小相符。

2.2 毒力基因擴(kuò)增

12 種毒力基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，4 株多殺性巴氏桿菌都含有pfhA、exBDtonB、nanB、oma87、ompH、hgbB、hgbA、sodC、sodA9 種毒力基因，而toxA、nanH、ptfA3 種毒力基因均沒(méi)有被檢測(cè)到。

2.3 耐藥性試驗(yàn)

參照NCCLS 藥敏紙片抑菌圈直徑評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的結(jié)果（表2）顯示：菌株P(guān)m01 對(duì)克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、卡那霉素、阿莫西林、頭孢噻吩和氨芐西林等7 種抗生素表現(xiàn)耐藥；菌株P(guān)m03 僅對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)耐藥；菌株1801 對(duì)克林霉素、大觀霉素、四環(huán)素、卡那霉素和新霉素等5 種抗生素表現(xiàn)耐藥；菌株1802 對(duì)克林霉素、大觀霉素、四環(huán)素、卡那霉素和新霉素等5 種抗生素表現(xiàn)耐藥。

表2 4 菌株耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 生物被膜形成能力測(cè)定

4 株多殺性巴氏桿菌生物被膜形成能力檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示：菌株P(guān)m03、1801 以及1803 幾乎不能形成生物被膜；而無(wú)論馬血清存在與否，菌株P(guān)m01 生物被膜形成能力顯著高于其他3 菌株，可形成極強(qiáng)的生物被膜（OD ＞3.0，P＜0.001）。

2.5 LD50 測(cè)定

使用4 株多殺性巴氏桿菌對(duì)21 日齡三黃雞攻毒，統(tǒng)計(jì)攻毒后7 d 內(nèi)三黃雞的死亡情況。通過(guò)LD50校正公式計(jì)算的結(jié)果（表3）顯示，菌株P(guān)m01、Pm03、1801 和1802 的LD50分別為1.33×10、2.74×102、4.22 和4.22 CFU。

表3 4 菌株LD50 測(cè)定結(jié)果

3 討論

引發(fā)巴氏桿菌病的臨床菌株多為莢膜毒力較強(qiáng)的多殺性巴氏桿菌。目前世界范圍內(nèi)引發(fā)多殺性巴氏桿菌病的主要病原菌株包括5 個(gè)莢膜血清型（A、B、D、E 和F）和16 種血清型，且以A 型為主，主要引起禽霍亂、豬肺疫、兔巴氏桿菌病等。本研究中，4 株雞源多殺性巴氏桿菌Pm01、Pm03和1801、1802 分別從安徽省和江蘇省雞場(chǎng)患有禽巴氏桿菌病的病死雞肝臟中分離得到，通過(guò)莢膜血清型檢測(cè)證明均為A 型。

禽巴氏桿菌能引起禽類急性出血性敗血癥，引起的病禽死亡率較高，且成年雞或火雞是其主要攻擊對(duì)象。本研究中，4 株禽多殺性巴氏桿菌對(duì)雞表現(xiàn)出很高的毒力，僅101～103個(gè)CFU 就能引起禽類發(fā)病死亡，推測(cè)這與禽多殺性巴氏桿菌攜帶的眾多毒力基因有關(guān)，這些基因包括黏附素基因（pfhA）、鐵攝取蛋白基因（exBDtonB、hgbB、hgbA）、唾液酸酶基因（nanB）、外膜蛋白基因（oma87、ompH）和超氧化物歧化酶基因（sodC和sodA）[9-11]。根據(jù)LD50測(cè)定結(jié)果，菌株1801 和1802 毒力明顯強(qiáng)于Pm01 和Pm03，但4 株菌攜帶的毒力基因相同，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是存在其他未知毒力基因。

抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)尤其是養(yǎng)禽業(yè)細(xì)菌性疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用，雖然在生產(chǎn)環(huán)節(jié)帶來(lái)了良好收益，但隨著濫用問(wèn)題的產(chǎn)生，也導(dǎo)致了日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性威脅。研究[18]顯示，臨床分離的多殺性巴氏桿菌已對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。胡恒龍等[19]對(duì)安徽省六安市禽多殺性巴氏桿菌進(jìn)行耐藥性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)32 株臨床株對(duì)林可霉素、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素和青霉素呈現(xiàn)出較高的耐藥性。此外，近年來(lái)禽多殺性巴氏桿菌臨床分離株多呈現(xiàn)出對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥性。本研究中4 株雞源多殺性巴氏桿菌臨床株同樣對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性。目前研究[20]認(rèn)為，這種耐四環(huán)素類藥物機(jī)制多是由于禽多殺性巴氏桿菌菌株的質(zhì)?；蛉旧w上攜帶了一種或多種外排泵基因。

生物被膜是細(xì)菌附著在生物或非生物表面，并由胞外基質(zhì)所包裹的系統(tǒng)化、組織化的細(xì)菌多細(xì)胞群落。生物被膜的形成有利于提高細(xì)菌對(duì)不利環(huán)境的抵抗，與細(xì)菌的致病性、耐藥性密切相關(guān)。本研究中，相較于其他3 株多殺性巴氏桿菌菌株，無(wú)論馬血清存在與否，菌株P(guān)m01 都具有較高的生物被膜形成能力。同時(shí)，其藥敏檢測(cè)結(jié)果也呈現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素（阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻吩）均表現(xiàn)出耐藥性，這一點(diǎn)與預(yù)期相符。此外，編碼β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因也能夠介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。雖然Pm01 菌株能夠形成較強(qiáng)的生物被膜，但其毒力低于1801 和1802 菌株，說(shuō)明禽多殺性巴氏桿菌的毒力與生物被膜形成能力不完全相關(guān)。