楊河，符敏，胡軍，梁振雄

（海南省瓊海市人民醫(yī)院普通外科，海南瓊海571400）

膽總管結(jié)石多發(fā)于膽總管下端，以膽色素結(jié)石為主，容易引發(fā)膽道感染[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，膽道感染導(dǎo)致病原菌大量繁殖，可增加膿毒血癥等并發(fā)癥發(fā)生率，進(jìn)而加重疾病進(jìn)展或者增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前，臨床上多采用抗生素類藥物治療膽總管結(jié)石患者膽道感染，由于病原菌的分布特點(diǎn)和抗生素的用藥習(xí)慣存在差異，以及抗生素濫用現(xiàn)象較為常見，細(xì)菌耐藥率呈上升趨勢(shì)，其中多重耐藥菌株比例也逐年增加，增加了醫(yī)院抗菌治療的難度[3-4]。研究[5]認(rèn)為，膽總管結(jié)石與病原菌感染、膽汁流出受阻、基因調(diào)控以及生物遺傳等因素密切關(guān)聯(lián)，其中病原菌感染可增加結(jié)石形成風(fēng)險(xiǎn)，李振毅等[6]研究發(fā)現(xiàn)膽道菌群與膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)存在相關(guān)性，研究結(jié)石復(fù)發(fā)的相關(guān)因素對(duì)于降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)以及指導(dǎo)醫(yī)生采取針對(duì)性抗菌治療具有重要臨床意義?；诖?，本文探討膽總管結(jié)石患者膽汁和腸道病原菌的分布特點(diǎn)，以及結(jié)石復(fù)發(fā)與病原菌的關(guān)系，旨在為臨床防治結(jié)石復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月—2021年6月于海南省瓊海市人民醫(yī)院普通外科接受治療的82例膽總管結(jié)石患者，男44例，女38例；平均年齡（48.5±8.7）歲。根據(jù)結(jié)石治療情況分為初發(fā)組和復(fù)發(fā)組，納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)多普勒超聲、CT等檢查確診為膽總管結(jié)石，主要臨床表現(xiàn)為右上腹或中上腹壓痛、發(fā)熱等；⑵可耐受逆行內(nèi)鏡胰膽管造影（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP），且取石順利，術(shù)中無大量出血、穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥；排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴嚴(yán)重心、肝、腎功能異常；⑵膽惡性病變；⑶精神狀態(tài)異常；⑷入組前接受過抗生素類藥物治療。該研究已獲該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者入組前均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集以及細(xì)菌培養(yǎng)

入組患者均在ERCP術(shù)中獲取膽汁、十二指腸液，具體過程如下：患者靜脈復(fù)合麻醉后行ERCP術(shù)，將消毒導(dǎo)管鏡緩慢伸入十二指腸球降部，抽取2～3 mL十二指腸液。更換切開刀，繼續(xù)插管，待ERCP術(shù)操作結(jié)束后經(jīng)鼻膽管留取2～3 mL膽汁。將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至無菌試管內(nèi)，送細(xì)菌室進(jìn)行培養(yǎng)、分析。

病原菌的分離、鑒定均按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，采用BSC II A2-1102型全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)箱(濟(jì)南安暢醫(yī)療設(shè)備有限公司)培養(yǎng)病原菌，采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行分析，采用VITEK 2 Compact型全自動(dòng)細(xì)菌儀進(jìn)行鑒定。

通過單樣本的Alpha多樣性評(píng)估微生物群落的多樣性以及豐度，主要包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)以及Chaol指數(shù)，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于估算多樣性，Chaol指數(shù)用于估算豐度，Shannon值越大、Simpson指數(shù)值越低則群落多樣性越高，Chaol指數(shù)越大則群落豐度越大。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用Shapiro-Wilk法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)分布性，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以例數(shù)（百分比）[n（%）]形式表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精準(zhǔn)概率法，膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)因素采用Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽汁、十二指腸液病原菌培養(yǎng)結(jié)果比較

共有56份（68.29%）膽汁標(biāo)本檢測(cè)出病原菌，44份（53.65%）十二指腸液標(biāo)本檢測(cè)出病原，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.536，P=0.060）（表1）。

表1 膽汁、十二指腸液病原菌培養(yǎng)結(jié)果比較（n）

2.2 感染病原菌分布情況

56份膽汁標(biāo)本共培養(yǎng)出68株病原菌，其中革蘭氏陰性菌48株（70.59%），革蘭氏陽(yáng)性菌18株（26.47%），真菌2株（2.94%）。44份十二指腸液標(biāo)本共培養(yǎng)出50株病原菌，其中革蘭氏陰性菌36株（72.00%），革蘭氏陽(yáng)性菌13株（26.00%），真菌1株（2.00%）。主要感染病原菌為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、屎腸球菌以及糞腸球菌，膽汁、十二指腸液中的革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌及真菌構(gòu)成比對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.111，P=0.946）（表2）。

表2 膽總管結(jié)石患者膽汁、十二指腸液感染病原菌特點(diǎn)

2.3 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組基線資料比較

82例患者中初發(fā)58例，復(fù)發(fā)24例。復(fù)發(fā)組的膽汁、十二指腸液感染率明顯高于初發(fā)組，患者入院后預(yù)防性使用抗生素藥物比例低于初發(fā)組（P＜0.05）（表3）。

表3 兩組基線資料比較

2.4 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組菌群多樣性分析

兩組患者的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而初發(fā)組的Chaol指數(shù)高于復(fù)發(fā)組（P＜0.05）（表4）。

表4 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組菌群多樣性分析（±s）

表4 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組菌群多樣性分析（±s）

組別初發(fā)組（n=58）復(fù)發(fā)組（n=24）t P Chaol指數(shù)425.16±81.55 390.44±72.73 37.157＜0.001 Shannon指數(shù)2.76±0.63 2.52±0.58 1.605 0.112 Simpson指數(shù)0.216±0.032 0.208±0.028 1.067 0.289

2.5 膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)因素分析

以是否復(fù)發(fā)（是=1，否=0）為因變量，以膽汁感染（是=1，否=0）、十二指腸液感染（是=0，否=1）、預(yù)防使用抗生素（是=0，否=1）為自變量，Logistic回歸分析顯示膽汁感染（OR=1.868，95%CI=1.069～3.266）、十二指腸液感染（OR=2.102，95%CI=1.116～3.959）均可增加膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，而預(yù)防使用抗生素是膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)的保護(hù)因素（OR=2.647，95%CI=1.354～4.581）（P＜0.05）（表5）。

表5 膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)因素分析

3 討論

既往研究認(rèn)為，健康人群的膽道系統(tǒng)為無菌環(huán)境，其中高濃度的膽汁酸鹽可抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而防止細(xì)菌內(nèi)毒素的生成，同時(shí)膽汁中含有豐富的炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子以及分泌型免疫球蛋白A，可有效抵抗腸原型病毒、細(xì)菌的侵襲。當(dāng)膽道系統(tǒng)發(fā)生結(jié)石時(shí)，可導(dǎo)致梗阻、狹窄，容易引起外源性細(xì)菌定植于膽道中，進(jìn)而引發(fā)膽道系統(tǒng)感染[7]。本次研究發(fā)現(xiàn)，82例患者中膽汁標(biāo)本與十二指腸液標(biāo)本檢測(cè)出病原菌的發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與吳曉燕等[8]研究結(jié)果相近。膽總管結(jié)石患者行ERCP術(shù)過程中，十二指腸內(nèi)的正常居住菌群可引發(fā)膽道系統(tǒng)感染，分析膽汁、十二指腸液的病原菌特點(diǎn)，可對(duì)術(shù)后帶菌原因進(jìn)行判斷[9-10]，從而指導(dǎo)抗菌治療。本研究通過對(duì)病原菌的分離、鑒定，結(jié)果顯示十二指腸液、膽汁中的細(xì)菌種類基本一致，主要感染病原菌為大腸埃希菌、腸球菌屬，該類菌屬均為腸道微生態(tài)定植菌，提示膽汁中的細(xì)菌系可能來源于十二指腸液污染，即取石操作破壞膽道結(jié)構(gòu)、乳頭括約肌，進(jìn)而導(dǎo)致腸道菌群移位至膽道[11]。十二指腸液的反流以及腸球菌屬中細(xì)菌菌體表面的抗膽鹽成分可使腸球菌屬進(jìn)入膽道系并增加存活機(jī)會(huì)，或者某些病理情況下引起腸道菌群異位，導(dǎo)致膽道內(nèi)細(xì)菌逆行感染，包括炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、屎腸球菌等，本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果基本相似[12-13]。同時(shí)本次研究發(fā)現(xiàn)，膽汁中可同時(shí)檢測(cè)出革蘭陰性菌以及革蘭陽(yáng)性菌，其原因可能與膽總管結(jié)石患者病情經(jīng)久不愈，住院時(shí)間較長(zhǎng)，膽道感染反復(fù)發(fā)作進(jìn)而導(dǎo)致不同類型細(xì)菌感染有關(guān)[14]。

ERCP術(shù)后仍有部分患者存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，這可能與膽道內(nèi)菌群變化有一定聯(lián)系。本次研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組24例患者中膽汁、十二指腸液感染率明顯高于初發(fā)組，而預(yù)防使用抗生素比例低于初發(fā)組。其原因可能是感染膽汁和十二指腸液中的細(xì)菌，特別是大腸埃希菌，可分泌大量的外源性β-葡萄糖醛酸苷酶可以水解結(jié)合膽紅素成葡萄糖醛酸和游離膽紅素，其能夠進(jìn)一步地結(jié)合膽汁中的鈣離子產(chǎn)生膽紅素鈣沉淀析出[15]。葉誠(chéng)等[16]研究亦發(fā)現(xiàn)膽道細(xì)菌感染可以改變膽汁的理化性質(zhì)，形成成石膽汁，然后在酸性促發(fā)物的作用下凝集成核，加速了結(jié)石的形成；而預(yù)防使用抗生素可以抑制膽汁、十二指腸液中細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而避免了外源性β-葡萄糖醛酸苷酶大量分泌，有效地抑制了結(jié)石的形成。

同時(shí)Logistic回歸分析顯示，膽汁感染、十二指腸液感染均可增加膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，而預(yù)防使用抗生素是膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)的保護(hù)因素。復(fù)發(fā)組變形菌門屬于腸道優(yōu)勢(shì)菌群，與大量腸道細(xì)菌移位至膽管有關(guān)，膽汁中的機(jī)會(huì)致病菌可引起多種感染，如絨毛膜羊膜炎、敗血癥、膿腫，以上可能與膽總管結(jié)石的復(fù)發(fā)存在相關(guān)性[17-18]。細(xì)菌入侵膽道后可釋放大量的β-葡萄糖醛酸酶入膽汁，進(jìn)而引起膽紅素二葡糖苷酸的去結(jié)合，最終形成不溶性的膽紅素鈣，從而促使膽泥和結(jié)石形成，增加結(jié)石復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；而預(yù)防使用抗生素可以抑制大量腸道細(xì)菌移位至膽管內(nèi)，減少β-葡萄糖醛酸酶入膽汁，進(jìn)而達(dá)到降低結(jié)石復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[19-20]。另外，復(fù)發(fā)組的Chaol指數(shù)低于初發(fā)組，表明復(fù)發(fā)組患者的膽道菌群豐度小于初發(fā)組，而兩組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組膽道菌群的多樣性具有相似性。在膽道感染的抗菌治療中，根據(jù)藥敏檢測(cè)結(jié)果合理選擇抗生素，并聯(lián)合用藥，對(duì)于重度感染者可采用碳青霉烯類抗生素控制感染，盡早解除膽道梗阻。比較十二指腸液、膽汁、糞便中的菌群變化，可更好揭示膽道菌群的來源和變化規(guī)律，同時(shí)增加菌群相關(guān)的代謝組學(xué)研究，從而提高研究的可靠性。

綜上所述，膽總管結(jié)石患者膽汁和十二指腸液腸道病原菌分布具有相似性，膽汁病原菌可能來自于十二指腸液，可增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，其中膽汁感染、十二指腸液感染均可增加膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，而預(yù)防使用抗生素是膽總管結(jié)石復(fù)發(fā)的保護(hù)因素。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。