趙秀雷，張雷，劉汝海，李鳳山，張執(zhí)全，孔德帥，張耀敏，石倩倩，劉婷婷

（河北省滄州市中心醫(yī)院肝膽胰外一科，河北滄州061000）

統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，全世界每年新增胰腺癌患者約46萬(wàn)例，死于胰腺癌的患者約為43萬(wàn)例，分別占所有惡性腫瘤的2.5%和4.5%，每年新發(fā)胰腺癌患者的比例雖然排在所有惡性腫瘤的第14位，但其病死率卻排在第7位，并且近年來(lái)胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，總體發(fā)病年齡呈下降趨勢(shì)[1-3]。胰腺癌早期診斷困難，接近一半的患者在確診時(shí)已處于晚期[4-5]。雖然不斷有新的靶向藥物、免疫藥物被應(yīng)用于臨床，但是胰腺癌患者的5年生存率仍不足10%[6]。胰腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的重要因素，但其機(jī)制尚不清楚[7]?，F(xiàn)階段研究[8-10]表明，作為MAPK通路的核心激酶，ERK1/2的磷酸化激活會(huì)顯著促進(jìn)下游增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，ERK1/2的激活是導(dǎo)致胰腺癌轉(zhuǎn)移的重要因素，調(diào)控ERK1/2則是治療胰腺癌的重要思路。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1（interferon-induced transmembrane protein 1，IFITM1）是一種分子量為17 kDa的膜蛋白，是在淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)同型黏附信號(hào)的膜復(fù)合物的一部分[11-13]。一項(xiàng)測(cè)序研究[14]結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFITM1的轉(zhuǎn)錄水平在胰腺癌組織中顯著升高，但是IFITM1蛋白在胰腺癌中的意義以及作用機(jī)制則仍不清楚。綜上，本研究主要分析IFITM1、ERK1/2在胰腺癌中的表達(dá)特點(diǎn)，并分析IFITM1調(diào)控胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選擇2018年6月—2021年6月間在河北省滄州市中心醫(yī)院肝膽胰外一科行手術(shù)治療的78例胰腺癌患者，收集患者手術(shù)切除的胰腺癌組織和癌旁正常組織（距腫瘤組織3 cm以上）。其中男47例，女31例；年齡41～74歲。根據(jù)全身正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（positron emission tomographycomputed tomography，PET-CT）的結(jié)果，將患者分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組。未轉(zhuǎn)移組患者46例，男28例，女18例；平均年齡（53.25±3.62）歲。轉(zhuǎn)移組共32例，男19例，女13例；平均年齡（54.42±3.79）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡在40～75歲之間；⑵確診為胰腺癌；⑶患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴收集前3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)胰腺癌相關(guān)治療；⑵合并血液學(xué)疾病、感染或炎癥；⑶合并其他癌癥。本研究經(jīng)過(guò)河北省滄州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 材料

人胰腺癌細(xì)胞PANC-1（ATCC，美國(guó)）。96孔、24孔組織培養(yǎng)板（康寧公司，美國(guó)）。RPMI 1640培養(yǎng)基和抗體（Gibco公司，美國(guó)）。IFITM1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及相應(yīng)的陰性對(duì)照（negative control，NC）（吉瑪公司，中國(guó)）。Lipofectamine?2000（Invitrogen公司，美國(guó)）。選擇性ERK1/2抑制劑LY3214996（Selleck公司，美國(guó)）?？贵w（Abcam公司，美國(guó)）。PDVF膜（Millipore公司，美國(guó)）。ECL顯色試劑盒和Nanodrop 2000儀器（Thermo Fisher公司，美國(guó)）。凋亡試劑盒（Annexin V-FITC和PI）（耶森公司，中國(guó)）。流式細(xì)胞儀（Becton公司，美國(guó)）。基質(zhì)膠和Transwell裝置（Corning公司，美國(guó)）。光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細(xì)胞PANC-1培養(yǎng)在RPMI1640完全基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素。將細(xì)胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃和95%濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、IFITM1組、IFITM1+LY3214996組。IFITM1組和IFITM1+LY3214996組細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)染IFITM質(zhì)粒來(lái)過(guò)表達(dá)IFITM1。將細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%匯合后，添加Opti（100μL）和LipofectamineTM2000（5μL）并孵育5 min作為試劑A。加入Opti（100μL）和IFITM1質(zhì)粒（20 ng/μL）并孵育5 min作為試劑B。將A和B混合在一起并孵育20 min。16 h后，更換培養(yǎng)基并收獲細(xì)胞。對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染等量的NC作為對(duì)照。IFITM1+LY3214996組的細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入終濃度為10 nmol/L ERK1/2通路抑制劑LY3214996。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 Western blot對(duì)于組織中的蛋白水平，按照分組將等量的組織一起裂解。組織或者細(xì)胞裂解后通過(guò)離心（4℃，12 000 r/min，5 min）收集總蛋白。通過(guò)10%的SDS-PAGE分離40μg的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PDVF膜上。加入5%脫脂牛奶（室溫，2 h）封閉后加入一抗（1∶1 000稀釋?zhuān)?°C，8 h），洗滌后加入二抗（1∶2 000稀釋?zhuān)覝兀? h）。條帶利用ECL可視化處理，GAPDH作為內(nèi)參，分析ERK1/2和p-ERK1/2的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活力將100μL的細(xì)胞懸浮液添加到96孔板的孔中，孵育24 h和48 h后，將體積為10μL的CCK-8溶液添加到每個(gè)孔中并孵育2 h。在450 nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔的光密度（OD）值。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡將細(xì)胞用1×PBS洗滌并懸浮在100μL結(jié)合緩沖液中。加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI，在室溫下于黑暗中孵育10～15 min。最后，將400μL的結(jié)合緩沖液添加到樣品中，并在1 h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移按照上述方法在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，形成單層細(xì)胞。然后使用200μL塑料移液器吸頭進(jìn)行劃痕。在0 h的劃痕寬度。倒出培養(yǎng)基，洗去劃掉的細(xì)胞，然后將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。再次拍照以評(píng)估劃痕的愈合情況。通過(guò)光學(xué)顯微鏡測(cè)量劃痕前緣遷移距離百分比。。

1.4.5 Transwell檢測(cè)侵襲將基質(zhì)膠（1∶8稀釋?zhuān)┘尤隩ranswell裝置的上室并在37°C下孵育30 min。將600μL完全培養(yǎng)基填充到4孔板-Transwell裝置的下室。將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)24 h進(jìn)行饑餓處理。消化后，向水合的Transwell上室中加入100μL細(xì)胞溶液（5×105個(gè)細(xì)胞/mL）。24 h后，洗去未侵入的細(xì)胞。滲入下室的細(xì)胞用95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min。在×400倍視野中的5個(gè)隨機(jī)視野中計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較通過(guò)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織中IFITM1的表達(dá)特點(diǎn)

IFITM1在胰腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織（3.85±0.34vs.1.00±0.08，P＜0.001）（圖1A）。IFITM1在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)移組胰腺癌組織（4.04±0.19vs.2.00±0.11，P=0.007）（圖1B）。

圖1 Western blot檢測(cè)IFITM 1蛋白表達(dá)A：胰腺癌組織與癌旁正常組織；B：有轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織與無(wú)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織Figure1 IFITM1 protein expressions detected by Western blot analysis A:Pancreatic cancer tissues and adjacent normal tissue;B:Pancreatic cancer tissueswith and without metastasis

2.2 各組細(xì)胞中IFITM1蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平比較

各組細(xì)胞中IFITM1蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。IFITM1組的IFITM1和p-ERK1/2/ERK1/2水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.001）。IFITM1+LY3214996組的p-ERK1/2/ERK1/2水平明顯低于IFITM1組（P＜0.001），但I(xiàn)FITM1水平與IFITM1組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IFITM1+LY3214996組的IFITM1蛋白水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.001），p-ERK1/2/ERK1/2水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組細(xì)胞中IFITM 1蛋白和ERK 1/2蛋白磷酸化水平Figure 2 The levels of IFITM1 protein and phosphorylation ERK 1/2 protein in each group of cells

2.3 IFITM1通過(guò)ERK1/2對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖活力的影響

各組細(xì)胞增殖活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IFITM1組的24、48 h的細(xì)胞增殖活力均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.001）；IFITM1+LY3214996組24、48 h的細(xì)胞增殖活力均明顯低于IFITM1組（均P＜0.001）；IFITM1+LY3214996組與對(duì)照組間24、48 h的細(xì)胞增殖活力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖3）。

圖3 CCK-8法檢測(cè)各組胰腺癌細(xì)胞的增殖活力（OD值）Figure 3 Theproliferativeability of each group of pancreatic cancer cellsdetected by CCK-8 assay(OD value)

2.4 IFITM1通過(guò)ERK1/2對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

各組細(xì)胞的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.1578，P=0.004）。IFITM1組的凋亡率明顯低于對(duì)照組[（3.86±0.41）%vs.（6.01±0.58）%，P=0.014]；IFITM1+LY3214996組的凋亡率明顯高于IFITM1組[（5.67±0.63）%vs.（3.86±0.41）%，P=0.027]；IFITM1+LY3214996組與對(duì)照組的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（5.67±0.63）%vs.（6.01±0.58）%，P＞0.05]（圖4）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組胰腺癌細(xì)胞凋亡情況Figure4 Theapoptosisin each group of pancreatic cancer cellsdetected by flow cytometry

2.5 IFITM1通過(guò)ERK1/2對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響

各組細(xì)胞遷移能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.715，P＜0.001）。IFITM1組的劃痕前緣遷移百分比明顯高于對(duì)照組[（86.23±4.61）%vs.（51.78±2.64）%，P＜0.001]；IFITM1+LY3214996組的劃痕前緣遷移百分比明顯低于IFITM1組[（48.82±3.12）%vs.（86.23±4.61）%，P＜0.001]；IFITM1+LY3214996組與對(duì)照組劃痕前緣遷移百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（48.82±3.12）%vs.（51.78±2.64）%，P＞0.05]（圖5）。

圖5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組胰腺癌細(xì)胞的遷移能力Figure 5 The migration ability of each group of pancreatic cancer cells analyzed by scratch healing experiment

2.6 IFITM1通過(guò)ERK1/2對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲的影響

3組細(xì)胞侵襲能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.286，P＜0.001）。IFITM1組的侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯高于對(duì)照組[（210.85±15.43）個(gè)vs.（104.47±10.86）個(gè)，P＜0.001]；IFITM1+LY3214996組的侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯低于IFITM1組[（112.35±14.94）個(gè)vs.（210.85±15.43）個(gè)，P＜0.001]；IFITM1+LY3214996組與對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（112.35±14.94）個(gè)vs.（104.47±10.86）個(gè)，P＞0.05]（圖6）。

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力Figure 6 The invasion ability of each group of pancreatic cancer cells analyzed by Transwell assay

3 討論

IFITM1是一種由干擾素誘導(dǎo)的蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、運(yùn)動(dòng)和分泌的作用[15-17]。近年來(lái)研究[18-20]表明IFITM1在喉癌、胰腺癌等中發(fā)揮促癌作用。Sakamoto等[21]的研究結(jié)果表明，IFITM1可參與細(xì)胞黏附和增殖的多聚體復(fù)合蛋白，IFITM1在肺癌組織中過(guò)表達(dá)并且促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。也有研究顯示IFITM1是膽囊癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志因子[22]。為分析IFITM1在胰腺癌中的意義，本研究在臨床上收集了胰腺癌組織和癌旁正常組織，結(jié)果顯示IFITM1在胰腺癌組織中顯著過(guò)表達(dá)。此外，根據(jù)腫瘤轉(zhuǎn)移情況分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，結(jié)果顯示出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的IFITM1蛋白水平顯著高于未轉(zhuǎn)移組。為進(jìn)一步分析IFITM1對(duì)胰腺癌細(xì)胞的影響，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染構(gòu)建了IFITM1過(guò)表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞模型，結(jié)果顯示提高IFITM1的水平會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力，并抑制凋亡。本研究結(jié)果提示IFITM1與胰腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，IFITM1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移來(lái)促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展。

為進(jìn)一步分析IFITM1促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展的機(jī)制，本研究也檢測(cè)了IFITM1對(duì)胰腺癌細(xì)胞中ERK1/2的影響。一項(xiàng)研究[23]顯示IFITM1可通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2的激活參與人類(lèi)矮小癥的發(fā)生。也有研究[24-25]顯示IFITM1的配體干擾素-γ可通過(guò)促進(jìn)ERK1/2的磷酸化激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，從而促進(jìn)肺癌進(jìn)展。ERK1/2蛋白已被證明參與胚胎發(fā)育、器官發(fā)生以及多種生理過(guò)程，包括、代謝、細(xì)胞周期、免疫等[26-27]。研究[28-30]顯示ERK1/2被磷酸化激活后會(huì)促進(jìn)細(xì)胞周期、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和抗凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)而參與胰腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。本次研究結(jié)果顯示IFITM1蛋白的水平升高后，胰腺癌細(xì)胞中的ERK1/2蛋白磷酸化水平顯著升高。此外，本研究也進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)，即利用ERK1/2抑制劑LY3214996來(lái)阻斷ERK1/2的激活。結(jié)果顯示抑制ERK1/2的激活可顯著的阻斷IFITM1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用，并降低IFITM1的抗凋亡作用。根據(jù)文獻(xiàn)，本研究結(jié)果說(shuō)明IFITM1促進(jìn)胰腺癌的作用與ERK1/2密切相關(guān)。

然而，本研究也存在不足之處，關(guān)于IFITM1與胰腺癌患者生存率之間的關(guān)系仍需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪研究。此外，IFITM1通過(guò)ERK1/2促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，IFITM1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制凋亡，IFITM1在胰腺癌組織中上調(diào)并可通過(guò)激活ERK1/2促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移。提示IFITM1可能成為診斷和治療胰腺癌的新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。