臧龍軍，陳東杰，高文哲，黃琿，朱紅偉，余梟

（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院肝膽胰II外科，湖南長沙410013）

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，是全球第12位常見惡性腫瘤[1]，也是癌癥死亡的第七大原因；在我國，2003—2013年居民癌癥數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第10位；其中胰腺導(dǎo)管腺癌的病死率在所有惡性腫瘤中位列第5位，5年相對生存率在常見惡性腫瘤中最差，僅為7.2%，且呈逐年惡化的趨勢[2]。胰腺癌起病隱匿，早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)后即處于局部進展期或遠處轉(zhuǎn)移期，可手術(shù)切除率低，超過80%患者會在手術(shù)切除后復(fù)發(fā)[3]，預(yù)后極差。而現(xiàn)階段仍缺乏針對中晚期侵襲性胰腺癌的治療手段，因此深入了解胰腺癌的分子病理學(xué)機制才能有助于開發(fā)高特異度、高效的靶向治療藥物[4]。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是不進行編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA，其中包括長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，是腫瘤進展中重要的調(diào)節(jié)因子，參與了包括增殖、遷移、分化、凋亡等眾多細胞事件。此外，它還參與各種細胞過程，并通過與miRNA、mRNA相互作用等多種機制參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程[5-8]。有研究報道lncRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]，lncRNA LINC00261的上調(diào)能明顯抑制胰腺癌在體內(nèi)及體外的細胞增殖和遷移[10]，lncRNA TP73-AS1通過miRNA-128-3p/GOLM1軸促進胰腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[11]。除此，對胰腺癌有影響的lncRNA還有BCAR4[12]、RP11-567G11.1[13]、CASC2[14]。

SOX21-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種位于人類13號染色體上長3 230 bp的lncRNA，為SOX21的反義基因，它與眾多惡性腫瘤關(guān)系密切，研究表明SOX21-AS1影響肺腺癌侵襲和遷移[15]及宮頸癌病程的進展[16]。但目前SOX21-AS1在胰腺癌中的作用暫不明確。本研究旨在探索SOX21-AS1在胰腺癌病程發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)作用及機制，以期對提高臨床的診治及改善預(yù)后發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系、細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組

5種胰腺癌細胞系（PANC-1、CAPAN2、CFPAC-1、BXPC3、SW1990）和人胰管上皮細胞系HPDE由美國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。所有細胞都在RPMI1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific），在37℃、5%CO2加濕環(huán)境中培養(yǎng)。根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）進行瞬時轉(zhuǎn)染。靶向SOX21-AS1的兩種siRNA購自ABC（Abcam，Cambridge，MA，USA）；miR-31-5p模擬物和miR-31-5p抑制劑購自Genechem（中國上海）。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析

通過TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）從組織或細胞中提取總RNA。用PARIS試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分離細胞核和細胞質(zhì)來源的RNA。使用SYBR PCR試劑盒（德泰生物，中國南京）對SOX21-AS1和MMP-16 mRNA進行定量。使用NCode miRNA qRT-PCR分析評估m(xù)iR-31-5p的表達水平。以GAPDH的表達水平為對照對SOX21-AS1的表達水平做標(biāo)準(zhǔn)化。將miR-31-5p的表達標(biāo)準(zhǔn)化為對照U6。本研究所使用的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

miR-31-5p模擬物，miR-31-5p抑制物及其陰性對照購自RiboBio（中國廣州）。為了抑制SOX21-AS1的表達，在U6/GFP/Neo質(zhì)粒（GenePharma，中國上海）中構(gòu)建了針對SOX21-AS1的siRNA序列（si-SOX21-AS1#1和si-SOX21-AS1#2），以攜帶非靶向序列的質(zhì)粒被用作對照。使用Lipofectamine 2000試劑進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，使用含有0.5 mg/mL G418的培養(yǎng)基（美國密蘇里州圣路易斯的Sigma-Aldrich）選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。本研究中使用的所有引物均來自Genechem（中國上海）。轉(zhuǎn)染所使用的miRNA及siRNA序列見表2。

表2 miRNA與siRNA序列Table 2 ThemiRNAand siRNAsequences

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測

使用pmirGLO熒光素酶表達載體（Promega，美國）構(gòu)建報告質(zhì)粒。通過從SOX21-AS1插入包含預(yù)測的miR-31-5p結(jié)合位點的片段，克隆了野生型SOX21-AS1（SOX21-AS1-WT）質(zhì)粒。通過使miR-31-5p的種子區(qū)域結(jié)合位點發(fā)生突變，可以創(chuàng)建一個SOX21-AS1基因突變質(zhì)粒（SOX21-AS1-MT）。將HEK293T細胞鋪在6孔板中，并用含有SOX21-AS1-WT或SOX21-AS1-MT片段和miR-31-5p模擬物或陰性對照的熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染。通過從miR-31-5p插入包含預(yù)測的MMP-16結(jié)合位點的片段，克隆了野生型MMP-16質(zhì)粒（MMP-16-WT）。通過使miR-31-5p的種子區(qū)域結(jié)合位點發(fā)生突變，可以創(chuàng)建一個MMP-16基因突變質(zhì)粒（MMP-16-MT）。將HEK293T細胞鋪在6孔板中，并用含有MMP-16-WT或MMP-16-MT片段和miR-31-5p模擬物或陰性對照的熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染。48 h后測定熒光素酶活性。

1.5 細胞活力測定

使用MTT法測定細胞增殖。將轉(zhuǎn)染的PANC-1或SW1990細胞接種在96孔板中，并在不同時間點（接種后1、2、3、4、5 d）測量細胞增殖。簡而言之，將MTT溶液（20μL，Sigma-Aldrich）添加到細胞中4 h，除去培養(yǎng)基，然后添加二甲基亞砜。使用Quant Universal Microplate分光光度計（BioTek，Winooski，VT，美國）測定490 nm處的吸光度。

1.6 集落形成試驗

轉(zhuǎn)染后將細胞添加到6孔板（500個細胞/孔）中。2周后，將細胞固定，染色，然后成像并使用光學(xué)顯微鏡計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并使用Student'st檢驗和單向方差分析進行評估。使用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析。所有檢驗均為雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX21-AS1在胰腺癌組織和細胞中的表達及對預(yù)后的影響

在使用qRT-PCR對20例胰腺癌患者的胰腺癌組織和匹配的鄰近癌旁組織中的SOX21-AS1表達水平進行檢測后，結(jié)果顯示，SOX21-AS1在胰腺癌組織中表達明顯高于癌旁組織（P＜0.01）（圖1A）。此外，實驗結(jié)果還顯示，與癌旁組織HPDE相比，胰腺癌細胞系PANC-1、CAPAN2、CFPAC-1、BXPC3、SW1990中SOX21-AS1表達均升高（均P＜0.05），其中SOX21-AS1在BXPC3、SW1990細胞中的表達高于其他細胞株，因此選用胰腺癌BXPC3、SW1990細胞為研究對象進行后續(xù)敲低實驗（圖1B）。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，SOX21-AS1高表達患者較其低表達患者預(yù)后差（P＜0.05）（圖1C），表明SOX21-AS1可能與胰腺癌病程發(fā)展的惡性程度密切相關(guān)。

圖1 胰腺癌中SOX21-AS1的表達及其對預(yù)后的影響A：qRT-PCR檢測20對胰腺癌標(biāo)本和鄰近正常組織中SOX21-AS1的表達量；B：qRT-PCR檢測不同胰腺癌細胞系與正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞中SOX21-AS1表達量；C：TCGA生物學(xué)數(shù)據(jù)庫分析SOX21-AS1表達對胰腺癌患者預(yù)后的影響Figure 1 Expression of SOX21-AS1 in pancreatic cancer and its association with the prognosis A:Relative expression of SOX21-AS1 detected by qRT-PCR in 20 cancer tissues and matched normal tissues;B:qRT-PCR analysis of the relative expression of SOX21-AS1 in pancreatic cell lines and normal pancreatic duct epithelial cell line;C:Influence of SOX21-AS1 on prognosisof pancreatic cancer patientsby TCGAanalysis

2.2 沉默SOX21-AS1表達對胰腺癌細胞活力及增殖的影響

由于SOX21-AS1在胰腺癌組織和細胞中表達上調(diào)且與胰腺癌病程發(fā)展的惡性程度呈正相關(guān)，進一步使用功能喪失實驗來確定其是否影響胰腺癌細胞的細胞活力及增殖水平。在使用靶向SOX21-AS1的兩種特定的siRNA轉(zhuǎn)染BXPC3、SW1990細胞后，qRT-PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組（si-NC）比較，BXPC3和SW1990細胞中，si-SOX21-AS1#1組與si-SOX21-AS1#2組中SOX21-AS1表達均降低（均P＜0.05）（圖2A），表明轉(zhuǎn)染后SOX21-AS1表達沉默，提示轉(zhuǎn)染成功（且si-SOX21-AS1#1組中的沉默效果更明顯，故在后續(xù)實驗中使用該組siRNA進行沉默）。隨后，通過MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BXPC3和SW1990細胞中si-SOX21-AS1#1組的細胞活力均較各自si-NC組明顯降低（均P＜0.05）（圖2B）。此外，克隆形成實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BXPC3和SW1990細胞中，si-SOX21-AS1#1組細胞增殖水平相較于si-NC組明顯下降（均P＜0.05）（圖2C）。這些數(shù)據(jù)表明，沉默SOX21-AS1的表達降低了胰腺癌細胞的細胞活力和增殖水平。

圖2 SOX21-AS1對胰腺癌細胞活力、增殖的影響A：qRT-PCR檢測SOX21-AS1沉默后胰腺癌BXPC3、SW1990細胞中SOX21-AS1表達量；B：MTT檢測BXPC3與SW1990細胞的活力；C：細胞克隆實驗檢測BXPC3和SW1990細胞的增殖能力Figure 2 Effect of SOX21-AS1 on viability and proliferation of pancreatic cancer cells A:The relative expression of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells after SOX21-AS1 silencing detected by qRT-PCR;B:Cell viabilities of HPDE and BXPC3 cells determined by MTTassay;C:Thecolony formations BXPC3 and SW1990 cells measured by colony-forming assay

2.3 SOX21-AS1的靶miRNA預(yù)測及驗證

研究[17]表明，細胞質(zhì)lncRNA最常見的機制是作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）來結(jié)合各種miRNA以抑制其對目標(biāo)mRNA的調(diào)節(jié)作用。為了確定SOX21-AS1是否可以作為miRNA的ceRNA，首先用qRT-PCR檢測了細胞核和細胞質(zhì)中SOX21-AS1的表達，結(jié)果顯示，SOX21-AS1轉(zhuǎn)錄本大多存在于細胞質(zhì)中（圖3A）。此外，通過DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測到SOX21-AS1與miR-31-5p存在靶向結(jié)合序列（圖3B）。在BXPC3、SW1990細胞中，轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物后，miR-31-5p表達相比陰性對照組（miR-NC）明顯升高（均P＜0.01）（圖3C）。為了進一步證實SOX21-AS1與miR-31-5p存在相互作用，將野生型（SOX21-AS1-WT）和突變型（SOX21-AS1-MT）結(jié)合miR-31-5p模擬物檢測熒光素酶活性，雙螢光素酶報告結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物后，SOX21-AS1-WT在BXPC3細胞中的相對熒光素酶活性明顯降低，而SOX21-AS1-MT的活性沒有明顯改變，同樣的，SOX21-AS1-WT在SW1990細胞中的相對熒光素酶活性也明顯減弱，而SOX21-AS1-MT的熒光素酶活性沒有明顯改變（P＜0.01）（圖3D），這不僅表明miR-31-5p是SOX21-AS1的直接靶標(biāo)，也能證明miR-31-5p與SOX21-AS1結(jié)合位點存在于突變載體附近。qRT-PCR結(jié)果表明，在BXPC3和SW1990細胞中，沉默SOX21-AS1會導(dǎo)致miR-31-5p表達明顯上調(diào)（P＜0.005）（圖3E）；與正常人胰腺組織相比，人胰腺癌組織中miR-31-5p的表達明顯降低（P＜0.01）（圖3F）。為了進一步驗證miR-31-5p與SOX21-AS1的關(guān)系，將SOX21-AS1與miR-31-5p行相關(guān)性分析，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SOX21-AS1的表達與miR-31-5p呈負相關(guān)（r2=0.257 1，P＜0.05）（圖3G）。

圖3 SOX21-AS1與miR-31-5p的關(guān)系分析A：核質(zhì)分離實驗檢測BXPC3與SW1990中SOX21-AS1的分布情況；B：DIANA預(yù)測SOX21-AS1與miR-31-5p中結(jié)合的靶向序列；C：qRT-PCR分析在BXPC3、SW1990細胞中過表達miR-31-5p后miR-31-5p的表達量；D：過表達miR-31-5p后，轉(zhuǎn)染SOX21-AS1-WT及SOX21-AS1-MT的BXPC3與SW1990細胞的雙熒光素酶實驗報告；E：qRT-PCR檢測干擾SOX21-AS1后BXPC3、SW1990中miR-31-5p的表達；F：qRT-PCR檢測20例胰腺癌及鄰近正常組織中miR-31-5p的表達；G：SOX21-AS1與miR-31-5p的相關(guān)性分析Figure 3 Analysis of the relationship between SOX21-AS1 and miR-31-5p A:The distributions of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells examined by nuclear cytoplasmic fractionation assay;B:The targeted binding sequence of SOX21-AS1 with miR-31-5Ppredicted by DIANA;C:The expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells after miR-31-5p overexpression;D:Relative luciferase activities in BXPC3 and SW1990 cells with miR-31-5p overexpression after transfection with SOX21-AS1-WT and SOX21-AS1-MT;E:Relative expression of miR-106a-3p in BXPC3 and SW1990 cells after SOX21-AS1 interference determined by qRT-PCR;F:Relative expression levels of miR-31-5p in 20 pairs of pancreatic cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR;G:Correlation analysis between SOX21-AS1 and miR-31-5p expression

為了進一步驗證SOX21-AS1靶向調(diào)控miR-31-5p的表達，進行了部分挽救實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抑制miR-31-5p表達后，與對照組（si-NC）比較，挽救組（si-SOX21-AS1+miR-31-5p inhibitor）組胰腺癌BXPC3、SW1990細胞中miR-31-5p表達均明顯降低（均P＜0.01）（圖4A），提示該miR-31-5p抑制物有效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沉默SOX21-AS1后，miR-31-5p的表達明顯上調(diào)，而在加入miR-31-5p抑制劑后，miR-31-5p的表達降低但仍明顯于高于si-NC組（P＜0.05）（圖4B）；同樣地，在沉默SOX21-AS1后，SOX21-AS1的表達明顯下調(diào)，而在給予miR-31-5p抑制劑后，SOX21-AS1的表達明顯上調(diào)，但仍低于si-NC組（P＜0.01）（圖4C）。此外，在對BXPC3和SW1990進行細胞活力檢測后發(fā)現(xiàn)，與si-NC比較，si-SOX21-AS1#1組中細胞活力明顯下降，在加入miR-31-5p抑制劑后出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)（均P＜0.05）（圖4D）。同時發(fā)現(xiàn)，在BXPC3、SW1990細胞中，與si-NC組比較，si-SOX21-AS1#1組中細胞增殖能力明顯減弱，在加入miR-31-5p抑制劑后，其增殖能力明顯恢復(fù)（均P＜0.01）（圖4E）。綜上提示，SOX21-AS1作為miR-31-5p的ceRNA在胰腺癌病程的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

圖4 SOX21-AS1靶向調(diào)控miR-31-5p表達的驗證A：qRT-PCR檢測使用miR-31-5p抑制劑后BXPC3、SW1990細胞中miR-31-5p的表達量；B：qRT-PCR檢測在BXPC3、SW1990細胞中，在si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑后miR-31-5p的表達量；C：qRT-PCR檢測在BXPC3、SW1990細胞系中，在si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑后SOX21-AS1的表達量；D：MTT實驗檢測si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入miR-31-5p抑制劑的BXPC3與SW1990細胞的細胞活力；E：細胞克隆實驗檢測在BXPC3、SW1990細胞中，加入si-SOX21-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和在此基礎(chǔ)上加入miR-31-5p抑制劑的細胞增殖能力Figure 4 Verification of targeted regulation of miR-31-5p expression by SOX21-AS1 A:The expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells transfected with miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;B:Relative expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addiction of miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;C:Relative expression levels of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addition of miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;D:Cell viabilities of BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addiction of miR-31-5p inhibitors detected by MTT assay;E:Proliferation abilities of BXPC3 and SW1990 cells after si-SOX21-AS1#1 transfection and miR-31-5p inhibitor addition detected by colony-forming assay

2.4 miR-31-5p的靶mRNA分析及驗證

為了進一步確定SOX21-AS1影響胰腺癌病程的機制，在DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測了miR-31-5p靶位點，發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1和MMP-16 mRNA包含與miR-31-5p相同的結(jié)合位點（圖5A）。為了證實miR-31-5p與MMP-16之間存在相互作用，將MMP-16-WT與MMP-16-MT（與miR-31-5p模擬物的結(jié)合位點突變序列）克隆到雙熒光素酶報告基因中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-31-5p模擬物明顯降低了BXPC3和SW1990中MMP-16-WT的細胞的螢光素酶活性（均P＜0.05），但在MMP-16-MT熒光素酶活性未見明顯變化（均P＞0.05）（圖5B）。此外，在胰腺癌腫瘤組織中MMP-16的表達遠高于正常胰腺上皮細胞的表達（P＜0.01）（圖5C），同時，在進行miR-31-5p與MMP-16相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)miR-31-5p的表達與MMP-16呈負相關(guān)（r2=0.311 3，P=0.010 6）（圖5D）。以上結(jié)果表明，miR-31-5p可能通過調(diào)節(jié)MMP-16參與胰腺癌病程的發(fā)生發(fā)展。

圖5 miR-31-5p靶向調(diào)節(jié)MMP-16 A：DIANA預(yù)測MMP-16與miR-31-5p中結(jié)合的靶向序列；B：加入miR-31-5p模擬物后，轉(zhuǎn)染MMP-16-WT與MMP-16-MT的BXPC3細胞與SW1990細胞的雙熒光素酶實驗；C：qRT-PCR檢測20例胰腺癌及鄰近正常組織中MMP-16的表達量；D：MMP-16與miR-31-5p的相關(guān)性分析Figure 5 Target regulation of MMP-16 expression by miR-31-5p A:The targeted binding sequence in miR-31-5Pwith MMP-16 predicted by DIANA;B:Relative luciferase activities in BXPC3 and SW1990 cells transfected with MMP-16-WT or MMP-16-MT after addition of miR-31-5p mimics;C:Relative expression levels of MMP-16 in 20 pairs of pancreatic cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR;D:Correlation analysis between MMP-16 and miR-31-5p expressions

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織和細胞系中SOX21-AS1水平升高，SOX21-AS1的下調(diào)抑制了胰腺癌細胞的活力和增殖。此外，還發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1和miR-31-5p表達之間存在相互抑制，這說明SOX21-AS1在胰腺癌細胞中存在通過miR-31-5p介導(dǎo)的促癌作用。本研究還證明了SOX21-AS1可通過抑制miR-31-5p來正向調(diào)節(jié)胰腺癌細胞中MMP-16的表達。

越來越多的證據(jù)表明，SOX21-AS1在多種類型的腫瘤中均起著腫瘤啟動子的作用。例如，在結(jié)直腸癌患者中觀察到SOX21-AS1的顯著高表達，而過表達的SOX21-AS1通過影響miR-145/MY06促進結(jié)直腸癌的發(fā)生進展[18]。SOX21-AS1在肝細胞癌[19]，胃癌[20]，三陰性乳腺癌[21]和骨肉瘤[22]中也上調(diào)。與這些報道一致，本研究觀察到胰腺癌組織和細胞系中的SOX21-AS1水平分別高于正常組織和HPDE6細胞，這表明SOX21-AS1可能是胰腺癌中的促癌基因。

lncRNA可作為ceRNA發(fā)揮作用，從而消除了miRNA對它們的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)源性抑制作用。通過核質(zhì)分離試驗及qRT-PCR檢測，筆者猜測SOX21-AS1可能在胰腺癌中通過ceRNA方式起作用。為了解SOX21-AS1在胰腺癌中影響的潛在機制，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，SOX21-AS1中存在miR-31-5p的靶向序列，并已觀察到miR-31-5p在致癌作用中起抑癌基因的作用。先前的研究[23]表明，miR-31-5p通過靶向細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1），從而作為腎細胞癌的腫瘤抑制因子。在膀胱癌[24]，鼻咽癌[25]，胃癌[26]和肝細胞癌中[27]，miR-31-5p表達也降低。同樣，本研究也確定在胰腺癌組織和細胞系中miR-31-5p減少。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1的下調(diào)顯著提高了miR-31-5p的水平，而在用miR-31-5p模擬物轉(zhuǎn)染的胰腺癌細胞中，SOX21-AS1的水平卻降低了；SOX21-AS1和miR-31-5p之間的互補對結(jié)合，并且進一步證明SOX21-AS1與胰腺癌組織中的miR-31-5p呈負相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，SOX21-AS1和miR-31-5p可能會形成相互抑制的反饋回路。

本研究探討了miR-31-5p是否會影響SOX21-AS1在胰腺癌細胞中的作用，結(jié)果揭示miR-31-5p抑制劑可以挽救SOX21-AS1的下調(diào)對胰腺癌細胞生存能力和侵襲的抑制作用。SOX21-AS1的下調(diào)通過調(diào)節(jié)miR-31-5p抑制了胰腺癌細胞的活力和侵襲力。但是，當(dāng)前的研究不能排除SOX21-AS1也可能影響胰腺癌中其他miRNA或相關(guān)基因的可能性，這需要進一步的研究。同時，在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析中，預(yù)測SOX21-AS1和MMP-16包含與miR-31-5p相同的結(jié)合位點。Zhang等[28]報道，miR-155通過靶向SOCS1和MMP-16促進乳腺癌細胞增殖和遷移。因此推測SOX21-AS1可能起抑制miR-31-5p的作用，從而正向調(diào)節(jié)MMP-16的表達。據(jù)相關(guān)文獻報道，MMP-16能誘導(dǎo)肝癌[29]、胃癌[30]等多種惡性腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移，而目前鮮有報道其在胰腺癌中的相關(guān)作用。本研究初步證明了SOX21-AS1能夠通過抑制miR-31-5p正向調(diào)節(jié)MMP-16表達，繼而增強胰腺癌細胞的增殖活力，這給未來MMP-16在胰腺癌中的研究提供了新的思路。

總之，胰腺癌組織和細胞系中的SOX21-AS1水平顯著降低，SOX21-AS1表達的下調(diào)通過miR-31-5p水平的上調(diào)降低了細胞活力和侵襲。這些結(jié)果表明，SOX21-AS1是預(yù)測預(yù)后的關(guān)鍵分子標(biāo)志物，并且有望成為胰腺癌治療中的重要靶標(biāo)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。