劉濤，周磊，肖晶晶，江建新

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，貴州貴陽550000；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科，湖北武漢430060）

胰腺癌是全球癌癥相關(guān)性死亡的主要原因之一，排在美國患者癌癥相關(guān)性死亡的第3位[1]，中國男性患者癌癥相關(guān)性死亡的第6位及女性患者的第7位[2]，且總體病死率仍呈上升趨勢，5年總體生存率亦只有10%[3]。其病情隱匿，早期不容易發(fā)現(xiàn)，約80%以上的患者診斷時(shí)可能已達(dá)癌癥進(jìn)展期或并發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。胰腺癌具有高度遷移性和侵襲性的特征[5]，腫瘤異質(zhì)性明顯，目前群體研究證據(jù)提供的治療方案對改善其預(yù)后的效果有限[6]，是造成胰腺癌容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后很差的主要因素[4,7]。研究[8-9]表明，癌基因的突變及分子調(diào)控關(guān)系等的改變會(huì)影響胰腺癌的惡性生物學(xué)特征，而抑制突變癌基因靶點(diǎn)的分子靶向治療策略可能使患者獲益。例如，近期的一項(xiàng)前瞻性III期臨床試驗(yàn)[10]顯示，聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑奧拉帕利可以使乳腺癌易感基因（BRCA）突變的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的無進(jìn)展生存期得到改善（7.4個(gè)月vs.3.8個(gè)月）。這一令人鼓舞的結(jié)果同時(shí)也凸顯了闡明胰腺癌的分子調(diào)控機(jī)制和尋找新的更有效的疾病治療靶點(diǎn)的重要性。

泛素/ISG15結(jié)合酶E2L6（ubiquitin/ISG15-conjugating enzyme E2 L6，UBE2L6）是編碼E2泛素結(jié)合酶家族的成員，也是翻譯后蛋白修飾的關(guān)鍵酶，有證據(jù)顯示其可以促進(jìn)干擾素刺激基因15（ISG15）與底物蛋白的共價(jià)連接，在白血病細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用[11]。研究[12]顯示，UBE2L6可能通過泛素化途徑介導(dǎo)了三氧化二砷/全反式視黃酸對C-myc的抑制作用，進(jìn)而抑制了FLT3-ITD突變引起的急性髓系白血病的進(jìn)展。另有研究[13]表明，UBE2L6可通過調(diào)控ATP結(jié)合盒亞家族B成員6（ABCB6）參與腫瘤細(xì)胞的順鉑耐藥。然而，其在包括胰腺癌在內(nèi)的大多數(shù)癌癥中的表達(dá)及生物學(xué)功能依然不清楚。筆者擬通過研究癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas Program，TCGA）和基因型-組織表達(dá)研究項(xiàng)目（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）的相關(guān)數(shù)據(jù)及臨床資料，分析UBE2L6在泛癌及胰腺癌中的表達(dá)情況，探究其與胰腺癌的臨床病理相關(guān)性及診斷預(yù)后價(jià)值，研究其對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力的影響，并討論其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)工具分析UBE2L6在泛癌及胰腺癌中的表達(dá)

從UCSC Xena（https://xenabrowser.net/datapages）下載泛癌數(shù)據(jù)，將經(jīng)過Toil流程統(tǒng)一處理的TCGA和GTEx的TPM格式的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換，用R（4.0.2）軟件的“l(fā)imma”包分析UBE2L6在泛癌中的差異表達(dá)，“ggplot2”包可視化其差異表達(dá)。進(jìn)一步在GEO數(shù)據(jù)集（Gene Expression Omnibus DataSets，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載GPL570文件，及GSE15471（包含39例胰腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織）和GSE16515（包含36例胰腺癌組織和16例癌旁組織）數(shù)據(jù)集，利用perl軟件將探針名轉(zhuǎn)換為基因名后，選取UBE2L6的表達(dá)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8繪制散點(diǎn)圖。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

所有胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3、PANC-1、AsPC-1、SW1990、MIA PaCa-2及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE均購自美國ATCC細(xì)胞庫。PANC-1、MIA PaCa-2、SW1990和HPDE、BxPC-3、AsPC-1細(xì)胞分別用含10%胎牛血清（Gbico，美國）的DMEM（Gbico，美國）和RPMI 1640（Gbico，美國）培養(yǎng)基置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）將UBE2L6的siRNA（Ribobio，中國）及陰性對照（negative control，NC）轉(zhuǎn)染入PANC-1和AsPC-1細(xì)胞內(nèi)，48 h后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測或細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

用RNA-easy Isolation Reagent試劑盒（Vazyme，中國）提取總RNA，并用分光光度計(jì)測定產(chǎn)物純度及濃度。然后用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，中國）和ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒（Vazyme，中國）進(jìn)行qPCR檢測，具體操作詳見說明書。本研究設(shè)計(jì)引物序列如下：UBE2L6 F：5'-TGG ACG AGA ACG GAC AGA TTT-3'，R：5'-GGC TCC CTG ATA TTC GGT CTA TT-3'；內(nèi)參基因GAPDH F：5'-AGG TCG GTG TGA ACGGATTTG-3'，R：5'-GGGGTCGTTGATGGCAAC A-3'。所有引物由上海生工生物股份有限公司合成。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

用CCK-8試劑盒（Bosterbio，中國）檢測胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。PANC-1和AsPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染入siRNA 48 h后以2×103/孔接種于96孔板中，在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、24、48、72、96 h后棄除原培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8稀釋液（CCK-8：培養(yǎng)基=1∶10）110μL，置于培養(yǎng)箱孵育2 h后測定450 nm波長下的吸光度。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將siRNA轉(zhuǎn)染入PANC-1及AsPC-1細(xì)胞48 h后，消化重懸細(xì)胞并按800/孔接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 d，磷酸鹽緩沖液漂洗后以4%多聚甲醛室溫下固定30 min，然后以0.1%結(jié)晶紫染色30 min后在顯微鏡下拍照。

1.6 Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

PANC-1及AsPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染入siRNA 48 h后，細(xì)胞消化重懸并以無血清培養(yǎng)基200μL稀釋后按5×104/孔接種于Transwell上室中（侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)先在上室加入Matrigel膠60μL，Matrigel：無血清培養(yǎng)基=1∶8），下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，磷酸鹽緩沖液漂洗后以4%多聚甲醛室溫下固定30 min，然后以0.1%結(jié)晶紫染色30 min后在顯微鏡下拍照。

1.7 分子相關(guān)性分析、蛋白相互作用及基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

分子相關(guān)性分析：將TCGA數(shù)據(jù)庫中UBE2L6的表達(dá)按中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，Spearman相關(guān)性分析尋找高風(fēng)險(xiǎn)組中相關(guān)性最大的基因，并用R（4.0.2）軟件的“ggplot2”包進(jìn)行可視化。蛋白互作分析：利用string數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）構(gòu)建UBE2L6的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。GSEA富集分析：根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中UBE2L6的mRNA表達(dá)中位數(shù)，將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用GSEA 3.0軟件中的KEGG基因集GeneSetsDebates:C2.CP.KEGG.V6.2.Symbols.gmt（Curated）進(jìn)行GSEA富集分析，設(shè)定循環(huán)次數(shù)為1 000次。以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25，P＜0.05為顯著富集的基因集合，進(jìn)一步篩選與UBE2L6密切相關(guān)的基因集用“ggplot2”進(jìn)行多基因富集分析及可視化。

1.8 UBE2L6表達(dá)水平與胰腺癌患者的臨床病理相關(guān)性分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載胰腺癌的轉(zhuǎn)錄組、基因表達(dá)量、HTSeq-FPKM及臨床數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)集截止到2021年4月20日。胰腺癌臨床數(shù)據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴病理確診為胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）；⑵臨床相關(guān)資料完整。除去部分信息缺失的個(gè)體，將168例胰腺癌納入本研究。根據(jù)UBE2L6的表達(dá)平均值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，用SPSS 26.0軟件分析其與臨床病理的相關(guān)性。用R（4.0.2）軟件的“Survival”包對患者的年齡、性別、分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UBE2L6表達(dá)水平等指標(biāo)進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，探討其對胰腺癌預(yù)后的影響。同時(shí)，提取TCGA（胰腺癌）和GTEx（正常組織）的RNA-seq數(shù)據(jù)（需要Log2轉(zhuǎn)換），用R（4.0.2）軟件的“pROC”包繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），分析UBE2L6對胰腺癌的潛在診斷價(jià)值。利用基因表達(dá)譜交互式分析數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn）的Kaplan-Meier生存分析評(píng)估UBE2L6對胰腺癌的預(yù)后價(jià)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用GraphPad Prism 8繪制統(tǒng)計(jì)圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）[M（IQR）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法；采用重復(fù)測量方差分析比較組內(nèi)及組間不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UBE2L6在泛癌中的表達(dá)

分析來自TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)UBE2L6在胰腺癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、宮頸鱗癌和腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、食管癌、多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、急性髓細(xì)胞樣白血病、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞肝癌、卵巢漿液性囊腺癌、前列腺癌、直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胸腺癌等24種癌癥中表達(dá)增高（圖1）。

圖1 UBE2L6在泛癌中的表達(dá)Figure1 Expressionsof UBE2L6 in pan-cancer

2.2 UBE2L6在胰腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)

為了探討UBE2L6在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，分析其在GEO數(shù)據(jù)集中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UBE2L6在胰腺癌組織中的表達(dá)水平相較于癌旁組織顯著增高（GSE15471：t=6.549，P＜0.001，GSE16515：t=4.502，P＜0.001）（圖2A-B）。同時(shí)，qRT-PCR檢測顯示，相比于正常胰腺上皮細(xì)胞HPDE，UBE2L6在胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3（t=33.82，P＜0.000 1）、PANC-1（t=7.36，P=0.001 8）、AsPC-1（t=9.61，P=0.000 7）、SW1990（t=10.26，P=0.000 5）及MIA PaCa-2（t=12.65，P=0.000 2）中表達(dá)均升高（圖2C）。

圖2 UBE2L6在胰腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)A：UBE2L6在GSE15471中的表達(dá)水平；B：UBE2L6在GSE16515中的表達(dá)水平；C：胰腺癌細(xì)胞中UBE2L6的相對mRNA表達(dá)Figure 2 Expressions of UBE2L6 in pancreatic cancer tissues and cell lines A:Expression of UBE2L6 in GSE15471;B:Expression of UBE2L6 in GSE16515;C:RelativemRNA expression of UBE2L6 in pancreatic cancer cell lines

2.3 UBE2L6促進(jìn)胰腺癌的增殖、遷移及侵襲

為探討UBE2L6對胰腺癌增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)功能的影響，設(shè)計(jì)了針對UBE2L6靶序列的siRNA（GCT GGT GAA TAG ACC GAA T）。qRT-PCR檢測提示，在PANC-1及AsPC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染UBE2L6的siRNA能明顯下調(diào)其表達(dá)水平（t=39.18，P＜0.000 1；t=47.87，P＜0.000 1）（圖3A）。隨后，將siRNA轉(zhuǎn)染入PANC-1及AsPC-1細(xì)胞行CCK-8、克隆平板及Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，同NC組比較，si-UBE2L6組的細(xì)胞增殖能力（均P＜0.05）及克隆形成能力均明顯下降（t=9.169，P=0.000 786；t=7.547，P=0.001 652）（圖3B-C），細(xì)胞遷移能力（t=6.510，P=0.002 874；t=7.562，P=0.001 639）及侵襲能力（t=9.999，P=0.000 562；t=9.651，P=0.000 645）亦明顯下降（圖3D-E）。

圖3 UBE2L6對胰腺癌細(xì)胞PANC-1和AsPC-1的增殖、遷移及侵襲的影響A：在UBE2L6敲低的PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中UBE2L6的相對mRNA表達(dá)水平；B：CCK-8檢測PANC-1和AsPC-1細(xì)胞的增殖；C：克隆平板實(shí)驗(yàn)檢測PANC-1和AsPC-1細(xì)胞的克隆形成；D：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測PANC-1和AsPC-1細(xì)胞的遷移；E：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測PANC-1和AsPC-1細(xì)胞的侵襲Figure 3 Influences of UBE2L6 on proliferation,migration,and invasion of pancreatic cancer PANC-1 and AsPC-1 cells A:Relative mRNA expression of UBE2L6 in UBE2L6-knockdown PANC-1 and AsPC-1 cells;B:The proliferation of PANC-1 and AsPC-1 cells detected by CCK-8 assay;C:The colony-forming capacity of PANC-1 and AsPC-1 cells detected by colony formation assay;D:The migration of PANC-1 and AsPC-1 cells detected by Transwell migration assay;E:Theinvasion of PANC-1 and AsPC-1 cellsdetected by Transwell invasion assay

2.4 UBE2L6的分子相關(guān)性、蛋白相互作用及GSEA富集分析

為進(jìn)一步探討UBE2L6的分子機(jī)制，Spearman相關(guān)性分析提示，B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)蛋白A1（BCL2A1）與UBE2L6的相關(guān)性最大（r=0.442）（圖4A）。蛋白相互作用分析顯示，排名前10位的關(guān)鍵蛋白分別為HERC6、RPS27A、HERC5、UBA52、ISG15、UBA7、DDX58、UBC、UBB、ARIH1（圖4B）。同時(shí)，GSEA富集分析提示，UBE2L6與腫瘤及免疫微環(huán)境等通路密切相關(guān)，ggplot2可視化展現(xiàn)10個(gè)[antigen processing and presentation，標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment score，NES）=2.201；apoptosis，NES=2.153；B cell receptor signaling pathway，NES=2.049；Chemokine signaling pathway，NES=2.216；cytokinecytokine receptor interaction，NES=2.223；MAPK signaling pathway，NES=2.108；natural killer cell mediated cytotoxicity，NES=2.207；pancreatic cancer，NES=2.056；pathways in cancer，NES=2.059；T cell receptor signaling pathway，NES=2.072]與癌癥及腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)且NES≥2.0、FDR＜0.001的數(shù)據(jù)集（圖4C）。

圖4 UBE2L6的分子相關(guān)性、蛋白相互作用及多基因GSEA富集分析A：UBE2L6分子相關(guān)性熱圖；B：UBE2L6的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；C：UBE2L6的多基因GSEA富集分析Figure4 Molecular correlation heatmap,protein interaction,and multi-genesetsenrichmentanalysisof UBE2L6 A:Molecular correlation heatmap of UBE2L6;B:Protein interaction network of UBE2L6;C:Multi-gene sets enrichment analysis of UBE2L6

2.5 UBE2L6表達(dá)水平與胰腺癌患者的臨床病理相關(guān)性及預(yù)后分析

臨床病理相關(guān)性分析結(jié)果顯示，UBE2L6的高表達(dá)與胰腺癌組織病理學(xué)分級(jí)相關(guān)（χ2=6.966，P=0.031）（表1）。單因素Cox回歸分析表明，患者年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UBE2L6的表達(dá)水平與胰腺癌患者的預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）；但是，多因素Cox回歸分析提示年齡及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），UBE2L6不是其獨(dú)立預(yù)后因素（P＞0.05）（表2）。進(jìn)一步利用TCGA數(shù)據(jù)庫的胰腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA富集分析，顯示UBE2L6與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)（NES=2.056，F(xiàn)DR=0.000）（圖5A）。同時(shí)，ROC曲線分析提示UBE2L6對胰腺癌具有較高的臨床診斷價(jià)值（AUC=0.970，95%CI=0.950～0.989）（圖5B），來自GEPIA數(shù)據(jù)庫的生存曲線分析亦提示UBE2L6的表達(dá)水平與胰腺癌患者的預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）（圖5C）。

圖5 UBE2L6與胰腺癌的關(guān)系A(chǔ)：UBE2L6富集于胰腺癌通路；B：UBE2L6的ROC曲線；C：UBE2L6的生存曲線Figure 5 Relationship between UBE2L6 and pancreatic cancer A:Enrichment of UBE2L6 in pancreatic cancer signaling pathway;B:ROCcurve of UBE2L6;C:Kaplan-Meier survival curve of UBE2L6

表1 UBE2L6表達(dá)水平與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relationship between theexpression of UBE2L6 and theclinicopathologic characteristics of pancreatic cancer[n(%)]

表2 單因素及多因素Cox回歸分析Table 2 Univariateand multivariate Cox regression analysis

3 討論

根據(jù)國際癌癥研究中心的數(shù)據(jù)[14]，2020年全球發(fā)生了1 930萬新癌癥病例和近1 000萬的癌癥死亡病例。預(yù)計(jì)2040年全球癌癥負(fù)擔(dān)將達(dá)到2 840萬例，比2020年增加47%。癌癥的異質(zhì)性是其診療困難的難點(diǎn)所在，泛癌的研究可以探討不同腫瘤間的差異及相似性，對腫瘤的分子機(jī)制、預(yù)后評(píng)價(jià)及個(gè)體化臨床診療有指導(dǎo)意義[15-16]。為探索UBE2L6在泛癌中的表達(dá)情況，本研究分析了TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫中33種腫瘤組織及正常組織的RNAseq數(shù)據(jù)，首次發(fā)現(xiàn)UBE2L6在胰腺癌等24種癌癥中表達(dá)增高，提示其可能是一個(gè)重要的癌癥基因，為后續(xù)揭示其在腫瘤中的作用提供了研究基礎(chǔ)。

UBE2L6作為一種翻譯后修飾的關(guān)鍵酶參與了蛋白質(zhì)的泛素化修飾[17]，在腫瘤細(xì)胞凋亡等病理生理過程中發(fā)揮作用[18]。Murakami等[13]的研究提示，UBE2L6在順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，本研究結(jié)果也顯示，UBE2L6在結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、腦膠質(zhì)瘤等組織或細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，表明UBE2L6可能在這些腫瘤中扮演著促癌基因的角色。然而，Liang等[12]的研究卻發(fā)現(xiàn)UBE2L6在FLT3-ITD突變的急性髓系白血病中可能起抑癌作用，這提示UBE2L6具有組織特異度表達(dá)的特征，在不同類型的腫瘤中可能發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。GEO數(shù)據(jù)庫存儲(chǔ)了大量高通量測序數(shù)據(jù)，可信度高，挖掘及分析整理這些數(shù)據(jù)可以為各種疾病的研究提供重要線索[19-20]。并且，多維度數(shù)據(jù)挖掘及分析驗(yàn)證也有利于排除樣本選擇偏倚，增加數(shù)據(jù)可信度[21]，而恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證又可以更確切地佐證研究結(jié)果[22-23]。本研究利用多個(gè)在線數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)UBE2L6在胰腺癌組織中高表達(dá)，并通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在胰腺癌細(xì)胞系中亦呈現(xiàn)高表達(dá)。為進(jìn)一步了解UBE2L6在胰腺癌中的生物學(xué)功能，筆者構(gòu)建靶向UBE2L6的siRNA進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，UBE2L6在體外促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，首次揭示了UBE2L6在胰腺癌中的促癌作用，并具有成為胰腺癌治療靶點(diǎn)的潛力，為后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，生物信息學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為分子生物學(xué)機(jī)制研究提供了新的見解[24-25]。本研究利用R語言等生物信息學(xué)技術(shù)探討了UBE2L6可能潛在的分子調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其與BCL2A1的相關(guān)性最大，而BCL2A1是重要的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑和核因子κB（NF-κB）的靶基因，在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體癌癥中過度表達(dá)對抗凋亡[26-27]，并有助于部分腫瘤的化療耐藥而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[28]。研究[12,17]表明，UBE2L6可以通過泛素化途徑降解并抑制C-myc的表達(dá)，也可以與塞內(nèi)卡病毒A的3D聚合酶相互作用并泛素化RNA依賴性RNA聚合酶。本研究中UBE2L6相互作用蛋白分析亦提示，UBE2L6可能與HERC6等與泛素相關(guān)的蛋白存在相互作用[29]，進(jìn)而通過蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等途徑對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生影響[30]。進(jìn)一步的GSEA富集分析顯示UBE2L6主要富集在MAPK通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子受體、抗原加工與呈遞、B細(xì)胞及T細(xì)胞受體等信號(hào)通路，揭示其還可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境參與對腫瘤的調(diào)控[31-32]。

為了探索，筆者通過GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)，UBE2L6在胰腺癌中顯著富集（FDR＜0.05），說明UBE2L6參與胰腺癌的病理生理過程，有一定的臨床研究價(jià)值。另外，ROC曲線分析顯示UBE2L6的AUC＞0.9，提示其在胰腺癌中具有較高的診斷效能，而Kaplan-Meier生存分析也發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與胰腺癌的不良預(yù)后緊密相關(guān)（P＜0.05），預(yù)示著UBE2L6表達(dá)量高的患者的中位生存時(shí)間可能更短。UBE2L6與胰腺癌的臨床病理相關(guān)性分析進(jìn)一步提示，雖然UBE2L6的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM臨床分期等無關(guān)（P＞0.05），但卻與胰腺癌的組織病理學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)（P＜0.05），意味著有血管浸潤等組織病理學(xué)分級(jí)晚的胰腺癌患者其UBE2L6的表達(dá)水平也更高。并且，后續(xù)的單因素Cox回歸分析亦發(fā)現(xiàn)UBE2L6的低表達(dá)可以改善胰腺癌患者的預(yù)后，這些結(jié)果都表明UBE2L6在胰腺癌的進(jìn)展中可能扮演著癌基因的角色，開發(fā)靶向抑制UBE2L6表達(dá)的藥物可能具有治療胰腺癌的潛力。遺憾的是，受到TCGA數(shù)據(jù)庫樣本量的限制，本研究的多因素Cox回歸分析顯示UBE2L6不是胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，這可能與本次納入的樣本量較少有關(guān)，有待進(jìn)一步的大數(shù)據(jù)庫整合研究證實(shí)。

綜上，本研究確定了UBE2L6在泛癌中普遍高表達(dá)，其高表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，并與其診斷及預(yù)后顯著相關(guān)。同時(shí)，UBE2L6可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，其分子機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡、泛素化修飾、MAPK信號(hào)通路以及對腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)等有關(guān)。未來，需要收集更多的臨床數(shù)據(jù)并增加生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索UBE2L6在胰腺癌中的功能及分子機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。