薛迪新，徐鈺，陳積賢，陳澄亮，賀新偉，梁美珍，吳偉力

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 溫州 325200，1.甲乳外科；2. 血液內(nèi)科

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率在我國呈逐年上升趨勢(shì)。乳腺癌一旦發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后將變差，如發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療困難。目前乳腺癌轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制仍不清楚，深入研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找侵襲和轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵的分子，對(duì)治療及改善乳腺癌患者的預(yù)后有極其重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中存在一種異常表達(dá)的非編碼circRNA CDR1as，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1-2]。在許多實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)circRNA CDR1as參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，比如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌[3-4]，而在乳腺癌組織中，研究也發(fā)現(xiàn)circRNA CDR1as表達(dá)升高[5]，目前相關(guān)文獻(xiàn)鮮有報(bào)道circRNA CDR1as是否參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，本研究將探討circRNA CDR1as在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲乳外科2018年6月至2019年9月手術(shù)切除的97例乳腺癌患者的癌組織及其距離癌組織2 cm的癌旁正常乳腺組織，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療及內(nèi)分泌治療，術(shù)中將標(biāo)本迅速放入液氮中速凍，然后保存在-80 ℃冰箱中用于RNA的提取。乳腺癌的TNM分期根據(jù)2017年美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)乳腺癌分期（第八版）。97例乳腺癌患者均為女性，其中乳腺導(dǎo)管原位癌10例，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌87例。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并批準(zhǔn)。

1.2 方法 采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）進(jìn)行RNA提取，取約60 mg的組織塊直接放入研體中，加入少量液氮，迅速研磨，加入TRIzol試劑，并用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT試劑盒（日本Takara公司），反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。RT-qPCR采用SYBR?Premix Ex TaqTMII（日本TaKaRa 公司），20 μL體系參照說明書，反應(yīng)條件如下： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參。RT-qPCR的引物序列具體如下：circRNA CDR1as正向引物5’-GAAA ATCCACATCTTCCAGACAA-3’，circRNA CDR1as反向引物5’-GAAGACATGGATATTGAGCCAGT-3’，β-actin正向引物5’-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，β-actin反向引物5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CircRNA CDR1as在乳腺癌組織中的表達(dá) 研究結(jié)果顯示，在97例乳腺癌組織中，circRNA CDR1as的相對(duì)表達(dá)量為1.217±0.609；而癌旁的正常乳腺組織中circRNA CDR1as的相對(duì)表達(dá)量為0.703±0.532，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示在乳腺癌組織中，circRNA CDR1as的表達(dá)升高。

2.2 CircRNA CDR1as在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá) 在97例乳腺癌組織中，導(dǎo)管原位癌為10例，浸潤性導(dǎo)管癌為87例。在乳腺導(dǎo)管原位癌中，circRNA CDR1as的相對(duì)表達(dá)量為0.711±0.332，而在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中circRNA CDR1as的相對(duì)表達(dá)量為1.278±0.608，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 CircRNA CDR1as表達(dá)與浸潤性癌臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果顯示，circRNA CDR1as在不同乳腺癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 CircRNA CDR1as的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

circRNA是一種非編碼RNA，一般通過海綿吸附微小RNA來發(fā)揮生物學(xué)功能。大量研究表明，在許多實(shí)體腫瘤中circRNA出現(xiàn)異常表達(dá)，同時(shí)研究顯示異常表達(dá)的circRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。SONG等[6]研究顯示，在宮頸癌中hsa_ circRNA_101996表達(dá)升高，升高的hsa_circRNA_ 101996通過下調(diào)miR-8075的表達(dá)激活TPX2基因的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。XU等[7]研究顯示，在卵巢癌中，circRNA-UBAP2表達(dá)升高，升高的circRNA-UBAP2通過調(diào)控miR-382-5p/PRPF8，來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡。DENG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌中，circRNA_0001946表達(dá)升高，升高的circRNA_0001946通過調(diào)控microRNA-135a-5p的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT），從而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而在乳腺癌中，同樣發(fā)現(xiàn)許多異常表達(dá)的circRNA，參與癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-11]。

在腫瘤細(xì)胞中circRNA的異常表達(dá)，可通過使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。REN等[12]研究顯示，在肝癌組織及細(xì)胞中，hsa_circ_ 0011946表達(dá)升高，沉默hsa_circ_0011946表達(dá)可抑制癌細(xì)胞EMT的過程，使肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移受到抑制。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，hsa_circ_0012563表達(dá)升高，通過沉默hsa_circ_0012563表達(dá)可抑制癌細(xì)胞EMT的進(jìn)程，使食管癌鱗狀細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移受到抑制[13]。而在非小細(xì)胞肺癌[14]、胃癌[15]、惡性膠質(zhì)瘤[16]中異常表達(dá)的circRNA也與腫瘤細(xì)胞的EMT有關(guān)。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)circRNA CDR1as在許多實(shí)體瘤中表達(dá)異常，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ZHANG 等[17]研究表明，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，通過過表達(dá)circRNA CDR1as，可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，而敲除circRNA CDR1as的表達(dá)，則會(huì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。LI等[4]同樣研究非小細(xì)胞肺癌發(fā)現(xiàn)在癌組織中 circRNA CDR1as表達(dá)升高，通過沉默circRNA CDR1as的表達(dá)，明顯抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步研究顯示，circRNA CDR1as可通過調(diào)控miR-219a-5p/SOX5軸發(fā)揮上述的致癌機(jī)制。TANG等[18]研究顯示，circRNA CDR1as在大腸癌組織中表達(dá)升高，升高的circRNA CDR1as與大腸癌的腫瘤的大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。YANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中，circRNA CDR1as表達(dá)升高，通過沉默RNA CDR1as的表達(dá)，來上調(diào)miR-7的表達(dá)，從而下調(diào)REGγ基因的表達(dá)，使耐藥的乳腺癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性增強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常的乳腺組織相比，乳腺癌組織中circRNA CDR1as表達(dá)升高，與YANG等[5]的研究結(jié)果相似。在收集的97例乳腺癌組織中，導(dǎo)管原位癌為10例，浸潤性導(dǎo)管癌為87例，與導(dǎo)管原位癌相比，在浸潤性導(dǎo)管癌中circRNA CDR1as表達(dá)升高。

進(jìn)一步分析87例浸潤性導(dǎo)管癌中circRNA CDR1as的表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系，研究結(jié)果顯示，circRNA CDR1as在浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)在不同乳腺癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有差異，提示circRNA CDR1as與乳腺癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)，后續(xù)還需進(jìn)一步研究。