李影，戴勝杰，孫學(xué)成，孔鴻儒，陳咨苗，孫洪偉

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.手術(shù)室；2.肝膽胰外科；3.內(nèi)分泌科

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是臨床上常見的急腹癥，急性肺損傷是其最常見的并發(fā)癥和死因[1]。發(fā)病時(shí)，胰腺自身消化酶激活對(duì)胰腺自身產(chǎn)生消化作用，胰腺局部的炎癥損傷導(dǎo)致熱休克蛋白（heat shock proteins, HSPs）從受損細(xì)胞向胞外釋放，而后通過血液循環(huán)到達(dá)全身各處，激活其他細(xì)胞表面模式識(shí)別受體，促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程[2]， 從而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起多臟器炎癥連鎖反應(yīng)及功能衰竭（其中肺臟器官最易受損）[3-4]。因此，本研究探討在AP炎癥反應(yīng)進(jìn)程中，HSP70是否通過攻擊肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。期望尋找有效的炎癥反應(yīng)靶點(diǎn)來遏制AP炎癥連鎖反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與抗體 小鼠HSP70 ELISA試劑盒（江蘇雨桐生物科技有限公司），TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（美國(guó)Proteintech公司），雨蛙素、LPS（北京索萊寶科技有限公司），HSP70抗體（美國(guó)Proteintech公司）。

1.2 AP小鼠造模方法及分組 本研究采用雌性NIH小鼠（體質(zhì)量約25 g），AP造模前禁食18 h，隨后連續(xù)腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg）6次，每次間隔1 h，末次腹腔注射雨蛙素后隨即注射脂多糖（10 mg/kg）； 對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。成功構(gòu)建對(duì)照組小鼠和AP小鼠模型組后，相應(yīng)對(duì)照組（n=6）、AP組（n=6）、HSP70+AP組（n=6）分別通過尾靜脈注射3次0.9%氯化鈉溶液、0.9%氯化鈉溶液和HSP70抗體，從而最終構(gòu)建本研究采用的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

1.3 胰腺組織含水量測(cè)定方法 處死小鼠后仔細(xì)解剖小鼠胰腺，剔除非胰腺組織，隨后分別測(cè)量解剖后胰腺組織質(zhì)量和經(jīng)60 ℃烘箱烘烤24 h后胰腺組織質(zhì)量，計(jì)算公式：胰腺組織含水量=（胰腺組織濕質(zhì)量-胰腺組織干質(zhì)量）/胰腺組織濕質(zhì)量× 100%。

1.4 HE染色 將不同實(shí)驗(yàn)組小鼠解剖后的胰腺組織和肺臟組織置于10%中性甲醛中固定，隨后通過石蠟包埋，后將石蠟切片、烤片，經(jīng)過切片脫蠟至水、蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)、脫水封片等步驟，最后將成型HE染色切片置于顯微鏡下觀察，采集實(shí)驗(yàn)圖像。

1.5 ELISA實(shí)驗(yàn) 收集處死后的不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血液，留置于紅蓋管中，室溫放置1 h，待血液凝固后置于離心機(jī)內(nèi)，2 000×g離心10 min，隨后收集相應(yīng)上清液，最后按照不同ELISA試劑盒說明書，按步分別檢測(cè)HSP70、TNF-α和IL-6（其ELISA試劑盒貨號(hào)分別為MM-0458M1、KE10002和KE10007）。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn) 將不同實(shí)驗(yàn)組小鼠肺臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行基礎(chǔ)比對(duì)，其基礎(chǔ)比對(duì)率均＞95%，保證樣本測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的有效性。差異表達(dá)基因（differentially expressed genes, DEGs）分析：通過R軟件包EdgeR，并設(shè)定顯著DEGs篩選閾值為FDR＜0.05且fold change＞2，篩選不同組之間的顯著DEGs；功能富集分析：通過GOKEGG對(duì)顯著DEGs進(jìn)行富集分析，縱坐標(biāo)為富集到的相關(guān)通路的具體描述，橫坐標(biāo)為富集比例（公式為富集到基因數(shù)除以基因組上該GO類別總注釋基因數(shù)）；基因互相作用網(wǎng)絡(luò)圖：通過富集分析篩選最相關(guān)的作用通路，將其中的富集DEGs取交集，通過String數(shù)據(jù)庫(kù)分析其間的作用，繪制DEGs互相作用圖。

1.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證RNA-seq的準(zhǔn)確性，我們挑選與炎癥密切相關(guān)的6個(gè)差異DEGs（Fos、FosB、CD274、calcitonin/Ramp2、CD36、NES）進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，提取不同實(shí)驗(yàn)組組織總RNA，并將不同組別RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入SYBR Green Master進(jìn)行RT-PCR，最后使用PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR定量分析，計(jì)算相應(yīng)2-ΔΔCt值，并進(jìn)行分析。GAPDH作為內(nèi)參。不同基因PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列（5’-3’）

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，每組數(shù)據(jù)分別獨(dú)立重復(fù)3次。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胞外HSP70在AP模型小鼠中起著促炎作用 通過解剖腹腔注射雨蛙素和脂多糖構(gòu)建的AP模型小鼠和相應(yīng)試驗(yàn)組小鼠，發(fā)現(xiàn)AP組的胰腺表現(xiàn)為最高的胰腺組織含水量，這與AP急性炎癥水腫相符合；其次，HSP70+AP組小鼠的胰腺含水量低于AP組，但高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖1A，結(jié)果初步表明HSP70抗體具有遏制AP進(jìn)程作用，但不能完全逆轉(zhuǎn)至治愈AP，故可初步推斷，胞外HSP70在AP進(jìn)程中起著促炎作用。HE染色結(jié)果顯示，AP組中的胰腺和肺臟組織較對(duì)照組明顯水腫，而HSP70+AP組的胰腺和肺臟組織水腫程度低于AP組，見圖1B。

圖1 胞外HSP70在AP小鼠模型中的促炎作用

2.2 胞外HSP70表達(dá)水平與促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平相關(guān) AP組小鼠的胞外HSP70水平顯著升高，而HSP70+AP組小鼠的胞外HSP70水平較AP組降低，但仍高于對(duì)照組小鼠（P＜0.05）；同時(shí)，AP組小鼠的TNF-α和IL-6水平亦明顯升高，其HSP70+AP組水平較AP組降低，但仍高于對(duì)照組小鼠（P＜0.05），見圖2。表明胞外HSP70在AP進(jìn)程中具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，而抑制胞外HSP70水平具有一定抑炎效果。

圖2 胞外HSP70及相關(guān)細(xì)胞促炎因子在各組小鼠中的表達(dá)

2.3 胞外HSP70與AP相關(guān)肺損傷的細(xì)胞黏附能力改變相關(guān) 通過DEGs分析可發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的肺組織在轉(zhuǎn)錄組水平上與AP組之間存在最多的DEGs，而AP組與HSP70+AP組之間的DEGs差距最小（見圖3A），這初步說明，在AP的炎癥進(jìn)程中，肺組織聯(lián)動(dòng)發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。通過對(duì)相關(guān)DEGs進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示，DEGs的功能主要集中在細(xì)胞黏附功能方面（見圖3B）。最后，我們通過篩選顯著DEGs高參與的ECM-receptor interaction、Cytokinecytokine receptor interaction、Focal adhesion、 PI3K-Akt信號(hào)通路中的差異基因交集，繪制了DEGs互相作用圖，為AP炎癥進(jìn)程中胞外HSP70造成的相關(guān)基因互作提供了關(guān)系圖（見圖3C）。

圖3 各組小鼠肺組織轉(zhuǎn)錄組分析

2.4 熒光定量PCR結(jié)果和RNA-seq結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致 為了驗(yàn)證RNA-seq的準(zhǔn)確性，我們挑選與炎癥密切相關(guān)的6個(gè)DEGs（Fos，F(xiàn)osB，CD274，calcitonin/ Ramp2，CD36，NES）進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在AP組中，CD36、NES、Calcitonin（Ramp2）的表達(dá)量顯著上升，而Fos、FosB和CD274表達(dá)量下降，見圖4，表明熒光定量PCR結(jié)果和RNA-seq結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖4 各組中顯著DEGs的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

AP作為一種急性起病的胰腺相關(guān)的全身性炎癥反應(yīng)性疾病，其病情兇險(xiǎn)、病程長(zhǎng)、病死率較高。在AP發(fā)展過程中，其炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)往往不僅局限于胰腺器官本身，常伴隨著機(jī)體其他遠(yuǎn)處器官的功能衰竭，如急性腎功能不全、急性呼吸窘迫綜合征等，其中又以急性肺損傷最為常見。急性肺損傷引發(fā)的肺泡毛細(xì)血管彌漫性損傷往往導(dǎo)致肺水腫和肺不張，臨床癥狀主要為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥，這又給AP的治療帶了阻礙[5]。本研究期望阻斷AP炎癥反應(yīng)進(jìn)程中的急性肺損傷來改善AP的預(yù)后。

HSPs在蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、生物合成等方面扮演著重要角色，而機(jī)體應(yīng)激時(shí)，大量HSPs釋放入血，參與全身性炎癥反應(yīng)過程。胞外HSP70作為重要的炎癥介導(dǎo)因子之一，在釋放入血后可能會(huì)引起胰外器官的炎癥損傷，這將是在AP發(fā)展進(jìn)程中阻斷急性肺損傷發(fā)生極為重要的一環(huán)。本研究結(jié)果顯示，AP小鼠在經(jīng)HSP70抗體處理后，人為地降低胞外HSP70表達(dá)水平，其胰腺組織和肺臟組織損傷程度較AP組明顯降低，同時(shí)TNF-α、IL-6等促炎因子濃度呈惡性循環(huán)式加重的現(xiàn)象也得到了明顯遏制?；谏鲜鼋Y(jié)果表現(xiàn)，我們初步推測(cè)在AP炎癥反應(yīng)過程中，胞外HSP70可能通過影響某些信號(hào)通路而加重AP肺損傷，抑制胞外HSP70可以明顯改善AP的肺損傷。

為了探討胞外HSP70發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用的分子機(jī)制，將不同實(shí)驗(yàn)組別肺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果表明：AP組與治療組之間的差異較小，說明有些免疫反應(yīng)是共同發(fā)生的，只有部分的免疫反應(yīng)是某一組特異的。DEGs的功能富集分析結(jié)果表明：DEGs顯著富集的通路有ECM-receptor interaction， Cytokine-cytokine receptor interaction，F(xiàn)ocal adhesion，PI3K/Akt等通路，這些通路都與細(xì)胞的黏附、炎癥反應(yīng)相關(guān)。進(jìn)一步的qRT-PCR結(jié)果驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，表達(dá)差異最顯著基因的改變趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，其中CD36水平亦在經(jīng)HSP70抗體處理后的AP組中較AP組下降，CD36可作為TLR4的輔助受體介導(dǎo)脂多糖相關(guān)的炎癥反應(yīng)，也可參與mTORC1信號(hào)通路中調(diào)控炎癥反應(yīng)[6-8]。相應(yīng)地，F(xiàn)os、FosB等分子表達(dá)水平亦與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路密切相關(guān)。因此，我們推測(cè)，胞外HSP70通過影響ECM-receptor interaction，Cytokine-cytokine receptor interaction，F(xiàn)ocal adhesion，PI3K/Akt等信號(hào)通路而加重炎癥損傷導(dǎo)致肺臟組織內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而達(dá)到誘發(fā)AP過程中急性肺損傷的作用。

在AP發(fā)展中，HSP70被大量釋放入血，通過影響ECM-receptor interaction，Cytokine-cytokine receptor interaction，F(xiàn)ocal adhesion，PI3K/Akt等信號(hào)通路，導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞因子釋放，損害內(nèi)皮細(xì)胞屏障，導(dǎo)致全身多臟器損傷，同時(shí)炎癥又反過來刺激釋放HSP70，最終導(dǎo)致AP患者的病情極速惡化，從而導(dǎo)致不良預(yù)后。假如能有效地阻斷胞外HSP70釋放，進(jìn)而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障不被破壞，將有效抑制AP發(fā)展過程中多臟器功能衰竭的惡化進(jìn)程，故繼續(xù)深入研究胞外HSP70在AP發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的具體機(jī)制，對(duì)AP的治療將產(chǎn)生巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。但本研究?jī)H研究了胞外HSP70促進(jìn)AP并發(fā)急性肺損傷的表象，初步探討了它發(fā)揮上述作用過程中可能影響的信號(hào)通路，未對(duì)其詳細(xì)的分子機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證，在接下來的研究中將選擇前述的幾條信號(hào)通路進(jìn)行逐一驗(yàn)證，期待能揭示胞外HSP70誘發(fā)AP肺損傷的具體機(jī)制。