王焓，段萍

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，黑龍江 哈爾濱 150000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325000

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是病因未明且難以根治的慢性炎癥性疾病[1]，大約有10%的育齡期女性受其影響[2]，對婦女的生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響，表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕和慢性盆腔疼痛等[3]。目前主流學(xué)說仍為Sampson學(xué)說，但月經(jīng)逆行的發(fā)生率和EMs的發(fā)病率存在顯著不符[4]，表明存在其他病因影響EMs的發(fā)病。因此，探索EMs的發(fā)病機(jī)制備受關(guān)注。

纖維化是指纖維結(jié)締組織在炎癥發(fā)生或受損組織內(nèi)及其周圍過度積聚[5]，是大多數(shù)慢性炎癥性疾病的一個(gè)病理特征，可以影響任何器官，輕則導(dǎo)致器官形成永久性瘢痕，重則導(dǎo)致器官功能失調(diào)和衰竭[6]。有研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾水平的改變可影響細(xì)胞纖維化的能力[7-8]，但目前m6A修飾對EMs纖維化的影響還未見報(bào)道。本研究旨在探討m6A去甲基化酶脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)（fat and obesityassociated，F(xiàn)TO）基因?qū)Ξ愇蛔訉m內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（ectopic endometrial stromal cells, eESCs）纖維化的影響及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 生物信息學(xué)分析 利用m6A2 Target數(shù)據(jù)庫（http://m6a2target.canceromics.org/）預(yù)測可能與FTO具有靶向關(guān)系的含m6A結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。

1.2 原代細(xì)胞培養(yǎng) 收集子宮肌瘤患者的在位內(nèi)膜組織與卵巢子宮內(nèi)膜異位瘤或深度浸潤性EMs患者的異位病變，并切成1 mm3的碎片，隨后與4%的IV型膠原酶（C5138，Sigma，美國）混勻，于37 ℃的恒溫水浴中消化45～60 min。消化后的組織經(jīng)充分過濾后獲得細(xì)胞懸液。于1 200×g，5 min離心細(xì)胞懸液，棄去上清液，用DMEM洗滌，重復(fù)3次。最終剩余的細(xì)胞重懸于含有15%胎牛血清（FBS，以色列）的DMEM中，并在37 ℃和5%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%時(shí)，用胰蛋白酶EDTA（0.25%，Gibco，美國）消化、傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime PCR，qRT-PCR） 用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）提取總RNA后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，上海）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO，上海）在qRT-PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中所用引物序列

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞并提取蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用15%的脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，分別加入FTO抗體（27226-1-AP，1:1 000）、COL-1抗體（14695-1-AP，1:1 000）、SMA抗體（14395-1-AP，1:1 000）、CTGF抗體（23936-1-AP，1:1 000）、FN抗體（15613-1-AP，1:1 000）、TLR2抗體（17236-1-AP，1:1 000）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases, p38）抗體（14064-1-AP，1:1 000）、磷酸-p38絲裂原活化蛋白激酶（phospho-p38 mitogen-activated protein kinases, p-p38）抗體（28796-1-AP，1:1 000）在4 ℃孵育過夜（抗體均購自武漢Proteintech公司），室溫用對應(yīng)的二抗孵育2 h，蛋白質(zhì)條帶通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）溶液進(jìn)行可視化。用ImageJ軟件對蛋白表達(dá)進(jìn)行量化。

1.5 M6A修飾的定量檢測 采用EpiQuik m6A RNA甲基化定量試劑盒（P-9005，EpiGentek，美國）測定RNA中總體m6A水平的變化。每個(gè)樣品分析的RNA均為200 ng，將RNA包被在檢測孔上。根據(jù)說明書，在孔內(nèi)加入相應(yīng)的緩沖液。最后在450 nm處檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算m6A水平。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)染 在HEK293T細(xì)胞中制備慢病毒，收集上清液用于eESCs的轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞融合密度達(dá)到50%～60%時(shí)，去除eESCs的原始培養(yǎng)基，加入慢病毒上清液與相同體積的完全培養(yǎng)基共培養(yǎng)，感染復(fù)數(shù)為120，同時(shí)加入聚丁烯（8 μg/mL）。轉(zhuǎn)染48 h后，嘌呤霉素（4 μg/mL）篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞并維持72 h。

為抑制TLR2的表達(dá)，從Ribo-Bio獲得針對TLR2和陰性對照（si-NC）的siRNA。siRNA轉(zhuǎn)染按說明書（賽默飛，美國）進(jìn)行。siRNA的靶序列為：si-TLR2 5’-GCTTCGATGTGGTTTG-3’。

1.7 EdU實(shí)驗(yàn) 用EdU試劑盒（C0071S，碧云天，上海）測定細(xì)胞增殖。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓 24 h后進(jìn)行檢測。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8 MeRIP-qPCR 通過離心柱提取完整的總RNA，通過polyATtract mRNA分離體系進(jìn)一步純化mRNA。使用Magna MeRIP m6A試劑盒（17-10499，Millipore，美國）進(jìn)行m6A RNA免疫沉淀。

1.9 RNA穩(wěn)定性檢測 用5 μg/mL放線菌素D（HY-17559，MCE，上海）處理細(xì)胞，抑制總體mRNA轉(zhuǎn)錄。在指定時(shí)間點(diǎn)（0、3、6 h）培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，提取RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR檢測TLR2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTO在EMs中低表達(dá) qRT-PCR顯示，m6A甲基化酶Mettl3明顯高表達(dá)，而m6A去甲基化酶FTO在EMs病變中的表達(dá)明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.01），見圖1A。原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（nESCs）相比，eESCs中的FTO表達(dá)顯著降低，m6A水平顯著增高（均P＜0.01），見圖1B、圖1C、圖1D、圖1E。

圖1 FTO在EMs中低表達(dá)

2.2 FTO過表達(dá)促進(jìn)eESCs纖維化并抑制其增殖 為探究FTO過表達(dá)對eESCs的影響，我們用慢病毒介導(dǎo)的FTO過表達(dá)載體（LV-FTO）和空載體（EV）轉(zhuǎn)染eESCs。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染LV-FTO后的eESCs形態(tài)上變得更加細(xì)長（見圖2A）。qRT-PCR顯示，與nESCs相比，eESCs中COL-1、SMA、CTGF、FN mRNA明顯高表達(dá)（P＜0.01），見圖2B。Western blot結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論（見圖2C）。EdU檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)TO過表達(dá)抑制了eESCs增殖（見圖2D）。

圖2 FTO過表達(dá)促進(jìn)eESCs纖維化并抑制其增殖

2.3 FTO通過介導(dǎo)TLR2的m6A修飾影響eESCs纖維化 生物信息學(xué)分析顯示，TLR2可能是FTO的潛在下游靶點(diǎn)（見圖3A）。因此，我們探究了FTO是否通過m6A RNA去甲基化的方式來影響TLR2的表達(dá)。與空載體相比，F(xiàn)TO的過表達(dá)提高了TLR2的蛋白水平（見圖3B），而對TLR2的mRNA水平幾乎沒有影響（見圖3C）。MeRIP-qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)TO過表達(dá)明顯降低了TLR2的mRNA轉(zhuǎn)錄物上的m6A水平（P＜0.01），見圖3D。RNA穩(wěn)定性檢測也證實(shí)，F(xiàn)TO過表達(dá)延長了TLR2 mRNA的半衰期，提高了TLR2的穩(wěn)定性（P＜0.01），見圖3E、圖3F。qRT-PCR結(jié)果顯示，TLR2敲除顯著降低了FTO過表達(dá)對纖維化的影響（見圖3G）。

圖3 FTO通過介導(dǎo)TLR2的m6A修飾影響eESCs纖維化

2.4 TLR2通過抑制p38促進(jìn)eESCs纖維化 Western blot結(jié)果顯示，TLR2敲除后p38的磷酸化水平顯著增強(qiáng)（P＜0.05），見圖4A、圖4B。在TLR2過表達(dá)的基礎(chǔ)上，我們通過p38的激活劑（dehydroaluminum chloride, DHC）增強(qiáng)p38水平。定量RT-PCR結(jié)果顯示，DHC成功抵消TLR2促進(jìn)eESCs纖維化的作用（P＜ 0.01），見圖4C。Western blot結(jié)果也得到一致結(jié)論（見圖4D）。

圖4 TLR2通過抑制p38促進(jìn)eESCs纖維化

3 討論

EMs的經(jīng)典定義是指子宮外異常位置存在子宮內(nèi)膜樣組織。雖然慢性炎癥是EMs公認(rèn)的特征，但該疾病的確切病因仍不明確。

既往研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的纖維化水平影響細(xì)胞增殖和遷移能力[5]，然而在EMs中纖維化機(jī)制探究尚未見報(bào)道，所以本研究中定位于EMs纖維化的機(jī)制探索。

m6A修飾是真核生物中mRNA最豐富的修飾，影響mRNA代謝的各個(gè)層面[9]。據(jù)報(bào)道METTL3敲低可促進(jìn)eESCs的遷移和侵襲，抑制Mettl3/m6A/miR126途徑可能通過增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲來促進(jìn)EMs的發(fā)展[10]。然而有關(guān)m6A修飾與EMs纖維化的關(guān)系還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)在EMs中FTO處于低表達(dá)狀態(tài)，過表達(dá)FTO可以通過TLR2/p38信號通路促進(jìn)eESCs纖維化并抑制細(xì)胞增殖。通過檢測纖維化標(biāo)志物COL-1、SMA、CTGF和FN的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在eESCs中提高FTO的表達(dá)，在體外具有促進(jìn)eESCs纖維化的作用。

Toll樣受體（TLRs）是屬于先天免疫的模式識別受體，可識別和防御入侵的微生物[11]。研究發(fā) 現(xiàn)，TLR2可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)組織纖維化[12]，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因啟動(dòng)子低甲基化與根尖周圍炎癥中促炎細(xì)胞因子和血管生成標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)[13]。本研究通過m6A2 Target數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)TLR2存在FTO發(fā)生m6A修飾的位點(diǎn)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)TO過表達(dá)促進(jìn)TLR2的蛋白表達(dá)，但不影響其mRNA水平。MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)在eESCs中FTO可通過m6A修飾的方式提高TLR2轉(zhuǎn)錄本水平，RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，F(xiàn)TO的過表達(dá)延長TLR2半衰期從而提高其穩(wěn)定性。此外，在本研究中，我們證實(shí)下調(diào)TLR2可以顯著逆轉(zhuǎn)FTO對eESCs纖維化的影響，磷酸化的p38顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，p38激活劑可顯著減低eESCs纖維化標(biāo)志物的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EMs中FTO呈低表達(dá)狀態(tài)，過表達(dá)FTO可以促進(jìn)eESCs的纖維化并抑制細(xì)胞增殖，而且這種作用與TLR2/p38信號通路相關(guān)。