劉 琳，周 芹,2,3,*，王皙瑋,2,3

(1.黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱 150080；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

0 引 言

噁草酸又名喔草酯(propaquizafop)，化學(xué)名稱(chēng)為：2-異亞丙基氨基氧乙基(R)-2-(4-(6-氯喹喔啉-2-基氧)苯氧基)丙酸酯，化學(xué)分子式為C22H22CLN3O5，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，屬于芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑[1]，主要用于防除一年生和多年生禾本科雜草[2]。為乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑，通過(guò)阻礙ACCase來(lái)抑制脂肪酸的合成，干擾細(xì)胞膜的形成,從而使雜草生長(zhǎng)停止，最終死亡，發(fā)揮除草的功能。具有內(nèi)吸性，對(duì)大豆、棉花、油菜、馬鈴薯和蔬菜等安全，在雜草幼苗期和生長(zhǎng)期施藥效果最好，且作用迅速[3]。

圖1 噁草酸的結(jié)構(gòu)式

自從上世紀(jì)80年代第一例芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑禾草靈被開(kāi)發(fā)，就以其高效、低毒、高選擇性的優(yōu)良特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注[4]。隨后，不斷合成出新品種，諸如苯并噻唑基、苯并咪唑基、喹啉基和吡啶并唑基等一系列新型芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)化合物，而到了90年代隨著對(duì)現(xiàn)有除草劑作用機(jī)制研究的深入，出現(xiàn)了基于乙酰輔酶A羧化酶的分子設(shè)計(jì)研究[5]，目前商品化的品種已達(dá)20多種，主要包括精喹禾靈、高效氟吡甲禾靈、噁草酸等，與其他的芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑相比，噁草酸主要用在大豆、棉花、油菜、甜菜、馬鈴薯、花生和蔬菜等作物上，2018年原藥及10%乳油在我國(guó)首次獲得登記。

目前，對(duì)于噁草酸的研究，主要集中在藥效[6-8]及殘留的檢測(cè)。郭松年等[9]利用 QuEChERs-液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定菜籽油中7種芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑殘留，其中就包括噁草酸，采用乙腈提取、分散固相萃取對(duì)樣品進(jìn)行前處理，質(zhì)譜采用MRM監(jiān)測(cè)模式，回收為78.3%～95.1%，具有基質(zhì)效應(yīng)低、處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確快速、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)；Shin Y等[10]同樣采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法建立了噁草酸及352種農(nóng)藥在食用昆蟲(chóng)中的聯(lián)合測(cè)定，方法具有較好的的準(zhǔn)確度及精密度；吳春英等[3]同樣采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法測(cè)定了水中的16種芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑，通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件及儀器條件，建立的方法具有檢出限低、回收率高的優(yōu)點(diǎn)。Saito-Shida S等[11]利用液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)，建立了糧谷及豆類(lèi)中噁草酸等153種農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法，結(jié)果表明，LC-QTOF-MS方法適用于谷物和豆類(lèi)中農(nóng)藥殘留的常規(guī)分析。噁草酸結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵，在紫外區(qū)具有光譜吸收，采用液相色譜分離，基質(zhì)包括土壤、植物、水以及食用昆蟲(chóng)等。目前的研究都是針對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，制劑有效成分檢測(cè)的報(bào)道較少。近年來(lái)，在我國(guó)隨著農(nóng)藥使用數(shù)量的增多，農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，根據(jù)《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》規(guī)定，農(nóng)藥所含有效成分種類(lèi)與農(nóng)藥的標(biāo)簽、說(shuō)明書(shū)標(biāo)注的有效成分不符，均視為假農(nóng)藥[12-13]，所以對(duì)制劑有效成分含量的檢測(cè)具有重要意義，本研究擬建立一種方法可以同時(shí)適用于噁草酸原藥(Technical material,簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)C)及乳油(Emulsifiable concentrate簡(jiǎn)寫(xiě)為EC)中有效成分的檢測(cè)，采用超高效液相色譜法，通過(guò)波長(zhǎng)掃描確定適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)，特異性檢驗(yàn)確定色譜峰純度，優(yōu)化了流動(dòng)性比例，建立的方法具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，并為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

甲醇：色譜純。水：新蒸二次蒸餾水或超純水。噁草酸標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%。Waters超高效液相色譜儀(UPLC)，二極管陣列檢測(cè)器(PDA),色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)。過(guò)濾器：濾膜孔徑約0.45 μm。超聲波清洗器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

色譜操作條件：流動(dòng)相：Ψ(甲醇∶水)=80∶20，經(jīng)濾膜過(guò)濾，并進(jìn)行脫氣。流速：0.2 mL·min-1。柱溫：35 ℃±2 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm。進(jìn)樣體積：0.5 μL。標(biāo)樣溶液和試樣溶液的制備：稱(chēng)取0.05 g(精確至0.000 1 g)噁草酸標(biāo)樣于100 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。測(cè)定及計(jì)算方法：在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰兩針噁草酸峰面積相對(duì)變化<1.2%時(shí)，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。將測(cè)得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標(biāo)樣溶液中噁草酸峰面積分別進(jìn)行平均。計(jì)算試樣中噁草酸的含量。

2 結(jié)果及分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

噁草酸分子中存在共軛雙鍵，價(jià)電子會(huì)發(fā)生能級(jí)躍遷，進(jìn)而產(chǎn)生紫外吸收光譜。為了找到噁草酸吸光值最大處吸收波長(zhǎng)，利用UPLC-PDA在200～400 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，紫外光譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，噁草酸的最大吸收波長(zhǎng)為235.2 nm，在農(nóng)藥分析中，一般情況下，如果最大吸收波長(zhǎng)處無(wú)干擾，分析檢測(cè)時(shí)選用最大吸收波長(zhǎng)[14]，本實(shí)驗(yàn)中235 nm波長(zhǎng)處?kù)`敏度較高，干擾小，能夠滿足分析的要求，故將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為235 nm。

圖2 噁草酸的紫外光譜圖

2.2 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

根據(jù)噁草酸的性質(zhì)，選用反相色譜進(jìn)行分析，常用的色譜柱包括C18、C8等，C18一般用來(lái)分析分子量較小的物質(zhì)，C8適合分析大分子類(lèi)的物質(zhì)。由于C18比C8的碳鏈更長(zhǎng)，帶來(lái)更好的保留特性。本實(shí)驗(yàn)中選擇常用的C18反相柱，根據(jù)噁草酸物化性質(zhì)和溶劑的紫外吸收波長(zhǎng)，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以甲醇和水作為流動(dòng)相，將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，隨著甲醇比例的增加，保留時(shí)間減小，最終選擇Ψ(甲醇∶水)=80∶20作為流動(dòng)相，流速0.2 mL·min-1。該條件下，噁草酸色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離(圖3)，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

圖3 噁草酸原藥及10%噁草酸乳油的UPLC色譜圖

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

特異性就是對(duì)峰純度進(jìn)行檢驗(yàn)，利用二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)同時(shí)采集數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，也賦予了其光譜比對(duì)的功能。峰純度色譜圖見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)不同的化合物具有不同的紫外吸收光譜形狀和吸光特性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)色譜峰純度的檢測(cè)。采用UPLC-PDA峰純度分析法來(lái)鑒別噁草酸。一般用純度角度與純度閾值比較，如果前者大于后者，說(shuō)明峰純度不夠，有共流出現(xiàn)象，反之，則認(rèn)為峰純度符合要求。本實(shí)驗(yàn)中噁草酸標(biāo)樣、92%噁草酸原藥、10%噁草酸乳油中的噁草酸峰純度角度均小于純度閾值，有效成分處無(wú)其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

圖4 HPLC-PDA峰純度色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系

按標(biāo)樣溶液的制備方法配制5個(gè)不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液，分別標(biāo)記為STD1至STD5。待儀器穩(wěn)定后，按照STD1至STD5的順序測(cè)定每個(gè)溶液中噁草酸的峰面積，取兩次測(cè)定的平均結(jié)果。以噁草酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)當(dāng)噁草酸質(zhì)量濃度為100.5～1 003.9 mg·L-1(進(jìn)樣體積1 μL)，與相應(yīng)的噁草酸峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計(jì)算得回歸方程為y=39 050x+97 636，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，完全可以滿足定量分析要求。本方法中噁草酸標(biāo)樣質(zhì)量濃度為 502.4 mg·L-1。

圖5 噁草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 方法精密度試驗(yàn)

按試樣溶液的制備方法配制5個(gè)92%噁草酸原藥精密度溶液，分別標(biāo)記為T(mén)C-A1～TC-A5；5個(gè)10%噁草酸乳油精密度溶液，分別標(biāo)記為EC-A1～EC-A5。以有效成分線性相關(guān)溶液STD3為標(biāo)樣溶液，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1～表2。農(nóng)藥測(cè)定和分析方法中，數(shù)據(jù)結(jié)果的確認(rèn)應(yīng)以修改的Horwitz公式(2(1-0.51ogC)×0.67)為依據(jù)[15]，RSD值小于這個(gè)修正值通常被認(rèn)為是合格的。由表1～表2可見(jiàn)，92%噁草酸原藥、10%噁草酸乳油中噁草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的RSD分別為0.39%、0.21%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.36(其中C=0.905 0)，表明有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

表1 噁草酸原藥精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 噁草酸乳油精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別稱(chēng)取約含0.025 g(精確至0.000 1 g)噁草酸的92%原藥、10%噁草酸乳油于100 mL容量瓶中，再加入噁草酸標(biāo)樣約0.025 g(精確至0.000 1 g)，按2.5.2試樣溶液的制備方法配制5個(gè)有效成分準(zhǔn)確度溶液，分別標(biāo)記為：TC-B1～TC-B5、EC-B1～EC-B5。以線性相關(guān)溶液STD3為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3～表4。92%噁草酸原藥、10%噁草酸乳油中噁草酸平均回收率分別為100.78%、100.44%，具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 噁草酸原藥回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 噁草酸乳油回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 不同實(shí)驗(yàn)室間方法驗(yàn)證

為了驗(yàn)證建立的方法在不同實(shí)驗(yàn)室的適用性，分別在3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，92%噁草酸原藥、10%噁草酸乳油樣品和標(biāo)樣重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.209 6%、1.559 5%，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDR分別0.454 0%、2.034 4%，均小于相應(yīng)的Horwitz公式理論計(jì)算值，表明不同單位間的檢測(cè)結(jié)果符合性良好，本文建立的噁草酸液相色譜分析方法可滿足日常檢測(cè)工作需要。

表5 不同實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

利用超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器，甲醇溶解，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，甲醇-水作為流動(dòng)相，等度洗脫，建立了在同一條件下噁草酸原藥及乳油的測(cè)定方法。在選擇提取溶劑時(shí)，既考慮溶劑本身的性質(zhì)，又要結(jié)合農(nóng)藥的物理化學(xué)性質(zhì)及樣品的狀況，噁草酸的溶解性，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑溶解樣品。

采用液相色譜配置的二極管陣列監(jiān)測(cè)器進(jìn)行紫外區(qū)全波長(zhǎng)掃描，得出噁草酸的最大吸收波長(zhǎng)，所選的波長(zhǎng)要避開(kāi)其他物質(zhì)的干擾。本實(shí)驗(yàn)選用235 nm作為測(cè)量波長(zhǎng)，干擾小，靈敏度較高，進(jìn)行了色譜峰特異性檢驗(yàn)(純度檢驗(yàn))，大多數(shù)情況下，純度檢驗(yàn)可輔助進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)。本研究建立的噁草酸的測(cè)定方法，兩種制劑中噁草酸的回收率、精密度、RSD值均滿足要求，具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間、靈敏度高、準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于噁草酸原藥及乳油中有效成分的分析測(cè)定。