丁宇斌，唐旭東

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome, MDS)是一組惡性克隆性造血干細(xì)胞疾病，其特征為髓系造血細(xì)胞一系或多系發(fā)育異常、骨髓無(wú)效造血，有較高風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病[1]。本文根據(jù)生物信息學(xué)篩選MDS和正常骨髓中的差異表達(dá)基因(differential expressed genes, DEG)，分析DEG表達(dá)譜的功能特征和篩選核心(hub)基因，以期從分子水平探討MDS疾病的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制，為MDS的臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源和DEG的篩選在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[2]搜索“myelodysplastic syndrome”芯片數(shù)據(jù)，物種選擇“Homo sapiens”，研究類型選擇“Expression profiling by array”，選擇GSE19429基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。使用GEO在線分析工具GEO2R進(jìn)行DEG分析，根據(jù)P<0.05且表達(dá)值增加或降低2倍以上進(jìn)行DEG篩選，去除探針無(wú)對(duì)應(yīng)基因者和重復(fù)基因。

1.2 DEG的GO功能和KEGG通路富集分析應(yīng)用WebGestalt[3](http://www.webgestalt.org/)分別進(jìn)行上調(diào)和下調(diào)DEG的GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析；并利用Hiplot平臺(tái)(https://hiplot.com.cn/)將富集分析結(jié)果繪制成氣泡圖。

GO功能富集分析的具體設(shè)置如下：物種選擇人類；分析方法選擇ORA(over-representation analysis)；功能數(shù)據(jù)庫(kù)選擇geneontology，并選擇生物學(xué)過(guò)程(biological process, BP)；參照集合(select reference set)選擇蛋白編碼基因組(genome protein-coding)。KEGG通路富集分析的具體設(shè)置如下：物種、分析方法選擇同前；功能數(shù)據(jù)庫(kù)選擇通路(pathway)并選擇KEGG；參照集合選擇同前。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及功能模塊分析使用STRING[4]version: 11.0(http://string-db.org)進(jìn)行DEG編碼蛋白和蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，物種選擇人類，高級(jí)設(shè)置中默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)類型為full STRING network，默認(rèn)蛋白互作評(píng)分閾值設(shè)置為中等置信度(medium confidence, 0.400)并認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，默認(rèn)FDR為medium(0.05)。

將STRING分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape[5](version 3.7.2)，并利用其插件MCODE(version 1.6.1)在PPI中構(gòu)建功能模塊，默認(rèn)設(shè)置Degree Cutoff=2，Cluster Finding=haircut，Node Score Cutoff=0.2，K-Core=2，Max. Depth=100；對(duì)功能模塊內(nèi)基因進(jìn)行GO功能的生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。

1.4 hub基因的篩選使用Cytoscape插件cytoHubba選擇“Degree”計(jì)算得到degree值TOP10的基因，將其作為hub基因。

1.5 hub基因的驗(yàn)證使用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)[6](version 4.5)(https://www.oncomine.org/)驗(yàn)證篩選得到在MDS患者與正常人樣本中hub基因的mRNA表達(dá)水平，分別檢索hub基因并設(shè)置過(guò)濾條件(Analysis Type: CancervsNormal Analysis；Cancer Type: Leukemia)，調(diào)整P值<0.01，差異倍數(shù)(fold change)=2，gene rank=Top 10%，選擇過(guò)濾結(jié)果中MDSvsNormal進(jìn)行Meta分析，完成MDS樣本中hub基因mRNA表達(dá)水平的驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 DEG篩選GSE19429中含183例MDS和17例健康者骨髓CD34+細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，經(jīng)GEO2R分析獲得33個(gè)上調(diào)DEG和98個(gè)下調(diào)DEG。

2.2 GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析根據(jù)GO功能富集分析結(jié)果，上調(diào)DEG的生物學(xué)過(guò)程顯著富集于Ⅰ型干擾素(interferon, IFN)誘導(dǎo)的信號(hào)通路及細(xì)胞對(duì)微生物的防御反應(yīng)(FDR<0.05，圖1)；下調(diào)DEG的生物學(xué)過(guò)程顯著富集于免疫應(yīng)答、抗原受體介導(dǎo)的信號(hào)通路和B細(xì)胞活化(FDR<0.05，圖2)。根據(jù)KEGG信號(hào)通路的富集分析結(jié)果，上調(diào)DEG未見顯著富集；下調(diào)DEG顯著富集于造血細(xì)胞分化和原發(fā)性免疫缺陷(FDR<0.05)。

圖1 上調(diào)DEG的GO功能富集分析結(jié)果

圖2 下調(diào)DEG的GO功能富集分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和功能模塊分析使用STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，上調(diào)DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)由31個(gè)節(jié)點(diǎn)和11條邊構(gòu)成(P<0.001，圖3)；下調(diào)DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)由90個(gè)節(jié)點(diǎn)和155條邊構(gòu)成(P<0.001)。上調(diào)DEG的顯著功能模塊由5個(gè)節(jié)點(diǎn)和10條邊構(gòu)成，5個(gè)節(jié)點(diǎn)(基因)分別為IFIT1、IFIT3、IFI27、IFITM1、IFI44L；下調(diào)DEG的顯著功能模塊由12個(gè)節(jié)點(diǎn)和53條邊構(gòu)成，12個(gè)節(jié)點(diǎn)(基因)分別為BLK、BLNK、RAG1、RAG2、EBF1、CD19、CD79B、IRF4、PAX5、IGLL1、DNTT、VPREB1。

圖3 上調(diào)DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)GO功能的生物學(xué)過(guò)程富集分析結(jié)果，上調(diào)DEG的顯著功能模塊內(nèi)基因富集于IFN-β信號(hào)通路和Ⅰ型IFN介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)(FDR<0.05)；下調(diào)DEG的顯著功能模塊富集于B細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞分化和抗原受體介導(dǎo)信號(hào)通路(FDR<0.05)。根據(jù)KEGG信號(hào)通路的富集分析結(jié)果，上調(diào)DEG的顯著功能模塊內(nèi)基因未發(fā)現(xiàn)富集的KEGG信號(hào)通路；下調(diào)DEG的顯著功能模塊富集于原發(fā)性免疫缺陷通路和B細(xì)胞受體信號(hào)通路(FDR<0.05)。

2.4 hub基因的篩選結(jié)果上調(diào)的hub基因僅5個(gè)，分別為IFI44L、IFIT3、IFIT1、IFITM1、IFI27；下調(diào)的hub基因TOP10分別為CD19、PAX5、RAG1、CD79B、CXCR4、IRF4、VPREB1、EBF1、RAG2、IGLL1。

2.5 hub基因在mRNA表達(dá)水平的驗(yàn)證MDS與正常樣本相比，CD19、RAG1、CD79B、CXCR4、IRF4、VPREB1、EBF1、IGLL1的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01，圖4)；IFITM1和RAG2未能進(jìn)行多數(shù)據(jù)集Meta分析，但單數(shù)據(jù)集驗(yàn)證IFITM1 mRNA表達(dá)水平在MDS中高于正常樣本(P<0.01)，RAG2 mRNA表達(dá)水平在MDS中低于正常樣本(P<0.01)。IFI44L、IFIT3、IFIT1、IFI27、PAX5的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

圖4 利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證hub基因mRNA表達(dá)水平的Meta分析

3 討論

目前認(rèn)為MDS可能存在免疫妥協(xié)的病理機(jī)制，外周血中漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞分泌IFN相對(duì)不足[7]，自然殺傷細(xì)胞減少且功能降低[8]，而髓源性抑制細(xì)胞數(shù)量增加且功能亢進(jìn)，抑制T細(xì)胞的增殖和功能[9-10]，高危MDS患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能亢進(jìn)[11]，負(fù)性調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)。本研究中GO和KEGG富集分析結(jié)果一致表明MDS可能存在免疫缺陷和免疫耐受。IFITM1是IFN刺激誘導(dǎo)后分泌的蛋白，能夠抑制病毒融合和釋放入胞。IFITM1在乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[12-14]。IFITM1在MDS中表達(dá)顯著上調(diào)可能是對(duì)Ⅰ型IFN分泌不足的一種細(xì)胞代償性反應(yīng)。

CD19是B淋巴細(xì)胞表面抗原，能夠調(diào)控B細(xì)胞的發(fā)育分化和活化；B細(xì)胞抗原受體是B細(xì)胞膜表面免疫球蛋白，需CD79A和CD79B輔助完成抗原刺激信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)，腫瘤浸潤(rùn)B淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中可能發(fā)揮著積極作用[15-16]。CD19和CD79B可能在MDS中低表達(dá)，即B淋巴細(xì)胞的免疫作用可能受到抑制，宿主免疫應(yīng)答低下可能是MDS惡性克隆、免疫逃逸和MDS疾病進(jìn)展的重要機(jī)制之一。

IRF4在B細(xì)胞的發(fā)育分化和淋巴細(xì)胞的增殖活化中起重要作用[17-18]，敲除IRF4后，小鼠活化的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)量明顯減少，血清免疫球蛋白水平顯著下降，T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用或抗腫瘤作用減弱。IRF4可能在MDS中低表達(dá)，并導(dǎo)致機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫受到抑制。VPREB1選擇性表達(dá)于B細(xì)胞發(fā)育的早期階段，所編碼的替代輕鏈(surrogate light chain, SLC)與Igα/Igβ(CD79A/B)異源二聚體參與前B細(xì)胞受體復(fù)合物的組成，在B細(xì)胞的陰性選擇中具有關(guān)鍵作用[19]。SLC缺失后，分泌自身抗體的B細(xì)胞在陰性選擇中可逃逸，血清中自身抗體的異常升高可能參與了多種自身免疫疾病的發(fā)病過(guò)程[20]。本研究結(jié)果表明：VPREB1和CD79B可能在MDS中低表達(dá)，提示MDS可能存在B細(xì)胞發(fā)育異常且分泌自身抗體的B細(xì)胞從陰性選擇中逃逸，引起MDS的免疫紊亂[21]。

綜上所述，在MDS中可能存在抗原受體介導(dǎo)的信號(hào)通路和B細(xì)胞活化等免疫應(yīng)答過(guò)程受抑制，因此低～中危MDS的治療可能需要增強(qiáng)免疫以抑制惡性克隆[22]，而非免疫抑制[23]。MDS在髓系細(xì)胞發(fā)育異常的同時(shí)可能存在B淋巴細(xì)胞發(fā)育異常，有助于從免疫表型特征上完善MDS的骨髓病理診斷[24]。增強(qiáng)腫瘤免疫在MDS的臨床治療中具有研究前景，值得進(jìn)一步探索。