周志毅，黃丹丹，楊樹(shù)東，郭 慶，饒 秋

目前，抗PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療可顯著改善多種癌癥的預(yù)后，包括胃癌。高微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)、高腫瘤突變負(fù)荷及PD-L1高表達(dá)是該療法重要的三個(gè)預(yù)測(cè)性指標(biāo)。然而，符合這三個(gè)指標(biāo)的患者對(duì)其治療反應(yīng)的差異仍較大[1]。有必要繼續(xù)尋找特異有效的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床獲益與SWI/SNF復(fù)合物亞基功能缺失/突變密切相關(guān)[2]。SWI/SNF復(fù)合物由10～15個(gè)亞基組成，其中20%以上的惡性腫瘤存在SWI/SNF復(fù)合物亞基基因突變，參與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。本研究利用公開(kāi)數(shù)據(jù)集分析胃癌中主要SWI/SNF亞基突變/缺失情況，及其與臨床預(yù)后、MSI、腫瘤突變負(fù)荷、免疫抑制分子表達(dá)及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)的關(guān)系，以探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫活性的關(guān)系，為其作為胃癌免疫治療反應(yīng)的有效標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TCGA和cBioPortal分析應(yīng)用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cbioportal.org)分析胃癌中主要SWI/SNF亞基突變/缺失的情況[5]，并下載胃癌數(shù)據(jù)(TCGA，Nature 2014)，分析其與MSI狀況及腫瘤突變率的關(guān)系。并進(jìn)一步分析SWI/SNF亞基突變/缺失及MSI狀況對(duì)腫瘤突變率的影響。

1.2 LinkedOmics數(shù)據(jù)分析使用LinkedOmics(http://www.linkedomics.org/login.php)[6]分析并下載數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析胃癌主要SWI/SNF亞基突變與預(yù)后，及其與腫瘤抑制分子PD-L1(CD274)/CTLA4基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性。

1.3 TISIDB分析應(yīng)用TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB)數(shù)據(jù)庫(kù)[7]分析主要SWI/SNF亞基突變與胃癌TILs之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)間的差別采用T檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，二元Logistic回歸模型對(duì)下載數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立性危險(xiǎn)因素分析。

2 結(jié)果

2.1 cBioPortal數(shù)據(jù)分析結(jié)果胃癌中SWI/SNF亞基突變/缺失占比前6位的亞基為ARID1A、ARID1B、ARID2、PBRM1、SMARCA2及SMARCA4，分別占32.4%(95/293)、10.6%(31/293)、9.2%(27/293)、7.8%(23/293)、8.9%(26/293)及6.8%(20/293)，合計(jì)占比42.3%(124/293)(圖1)。其突變/缺失常多個(gè)同時(shí)存在，≥2個(gè)者占44.4%(55/124)(圖2)；且其突變/缺失均與高M(jìn)SI(表1)及高腫瘤突變率(表2)呈顯著相關(guān)性。

表1 TCGA數(shù)據(jù)示SWI/SNF亞基突變/缺失與MSI的相關(guān)性

表2 TCGA數(shù)據(jù)示SWI/SNF亞基缺失/突變中腫瘤突變率改變

圖1 cBioPortal中TCGA數(shù)據(jù)示胃癌6個(gè)主要SWI/SNF亞基突變/缺失情況

圖2 TCGA數(shù)據(jù)示胃癌中主要SWI/SNF亞基同時(shí)缺失/突變數(shù)：≥2個(gè)同時(shí)缺失/突變者占44.4%；1～6代表SWI/SNF亞基同時(shí)缺失/突變的數(shù)目

2.2 LinkedOmics數(shù)據(jù)分析結(jié)果LinkedOmics分析示：胃癌中各個(gè)主要SWI/SNF亞基突變患者的預(yù)后相對(duì)較好(表3)。本組進(jìn)一步下載數(shù)據(jù)，根據(jù)亞基同時(shí)突變數(shù)將患者分為<2個(gè)組和≥2個(gè)組，≥2個(gè)組患者的預(yù)后顯著較好(χ2=4.972，P=0.026，圖3)。主要SWI/SNF亞基突變與免疫抑制分子CD274及CTLA4 mRNA表達(dá)具有顯著相關(guān)性(表4、5)，除了SMARCA4突變，可能與其占比較少有關(guān)。

圖3 LinkedOmics數(shù)據(jù)示多個(gè)SWI/SNF亞基同時(shí)突變患者的總生存率

表3 LinkedOmics分析主要SWI/SNF亞基突變患者的總生存率

表4 LinkedOmics分析SWI/SNF亞基突變與CD274 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

表5 LinkedOmics分析SWI/SNF亞基突變與CTLA4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.3 TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析示：主要SWI/SNF亞基突變與TILs中CD4+和CD8+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)有顯著相關(guān)性(表6，圖4)，說(shuō)明其可能作用于腫瘤免疫活性。

表6 TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析主要SWI/SNF亞基突變與TILs的關(guān)系

圖4 ARID1B突變胃癌TILs中活化CD4+(A)、CD8+(B)T細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)(C)改變

2.4 Logistic回歸分析結(jié)果以腫瘤突變率高、低作為因變量(以突變率高四分位為界，分為低突變率和高突變率)，運(yùn)用Logistic回歸分析MSI、分子分型、SWI/SNF亞基缺失/突變及拷貝數(shù)在胃癌腫瘤突變率中的影響。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)SWI/SNF亞基缺失/突變與MSI、分子分型均是腫瘤突變率的獨(dú)立性相關(guān)因素(表7)。

表7 Logistic回歸分析MSI、分子分型、SWI/SNF亞基缺失/突變及拷貝數(shù)對(duì)胃癌腫瘤突變率的影響

3 討論

本組結(jié)果顯示ARID1A、ARID1B、ARID2、PBRM1、SMARCA2、SMARCA4是胃癌中SWI/SNF復(fù)合體亞基發(fā)生突變/缺失的6個(gè)主要亞基，占比近一半。胃癌的區(qū)域化研究顯示有30%的胃癌存在染色質(zhì)重塑物的體細(xì)胞突變，包括ARID1A、SMARCA2和SMARCA4等，且發(fā)生在早期致癌階段[8]。表明SWI/SNF亞基突變/缺失可能涉及胃癌的致癌機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，主要SWI/SNF亞基突變病例的總生存率均相對(duì)較高，且≥2個(gè)亞基同時(shí)突變/缺失者的預(yù)后較好。可能因SWI/SNF亞基功能具有相互補(bǔ)償作用，可改善某一亞基功能失活的影響[3]，其功能障礙可能與多個(gè)亞基同時(shí)異常有關(guān)，本組亦發(fā)現(xiàn)胃癌中SWI/SNF亞基突變/缺失有近一半為多個(gè)同時(shí)存在。目前，對(duì)于胃癌中SWI/SNF亞基異常的臨床病理及預(yù)后意義尚存在爭(zhēng)議。有研究通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)，ARID1A缺失與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化顯著相關(guān)，ARID1A缺失表達(dá)是預(yù)后不良的獨(dú)立因素[9]。然而，也有研究顯示ARID1A表達(dá)與胃癌患者生存率之間無(wú)相關(guān)性[10]。Zou等[11]發(fā)現(xiàn)早發(fā)性胃癌中ARID1A蛋白表達(dá)降低與TILs密度顯著相關(guān)，ARID1A基因突變患者比野生型患者具有更長(zhǎng)的生存期，ARID1A蛋白低表達(dá)或表達(dá)異質(zhì)性較低的患者具有更好生存期的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，SWI/SNF亞基突變與免疫抑制分子PD-L1及CTLA-4高表達(dá)、高TILs、高M(jìn)SI以及高腫瘤突變率有顯著相關(guān)性。有觀點(diǎn)認(rèn)為，SWI/SNF亞基失活突變?cè)谥掳┳饔门c抑癌的免疫原性之間存在平衡[12]。

分子分型包括EBV型、基因組穩(wěn)定型、染色體不穩(wěn)定型及MSI型本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SWI/SNF亞基突變/缺失可能是除高M(jìn)SI以外，導(dǎo)致腫瘤免疫活性升高的另一個(gè)重要因素。SWI/SNF亞基突變/缺失與高M(jìn)SI的高度相關(guān)性說(shuō)明兩者可能協(xié)同導(dǎo)致腫瘤的免疫活性升高。本組經(jīng)回歸分析發(fā)現(xiàn)，SWI/SNF亞基突變/缺失及MSI均是導(dǎo)致高腫瘤突變率的獨(dú)立自變量，兩者作用于腫瘤免疫活性具有相對(duì)獨(dú)立性。富集分析顯示，在ARID1A突變胃腸癌中，多個(gè)上調(diào)信號(hào)途徑均與腫瘤免疫活性顯著相關(guān)[13]，應(yīng)考慮將前者作為胃癌免疫療法的預(yù)測(cè)標(biāo)記。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌中主要SWI/SNF亞基突變/缺失可能與MSI協(xié)同，并可獨(dú)立作用于胃癌的腫瘤突變率、腫瘤免疫活性和免疫抑制分子表達(dá)等變量，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，并使這部分胃癌亞型具有積極的免疫治療反應(yīng)，可將其作為鑒定或預(yù)測(cè)胃癌患者對(duì)免疫療法是否有效的標(biāo)記。