閆嵩 柳馳 任偉超 劉秀波 徐姣 馬偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱，150040)(開姆尼茨工業(yè)大學，德國·開姆尼茨)(黑龍江中醫(yī)藥大學)

柳葉芹(Czernaevialaevigataturcz.)是傘形科多年生植物。從形態(tài)學研究可知，傘形科植物的果實，因其具有豐富的變異和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而成為最顯著的分類器官；傘形科物種果實的翅、油管、內(nèi)果皮、心皮柄等特征，被用于物種的分類[1-5]；但也有研究認為，這些變異的果實性狀很難推斷出傘形科物種內(nèi)部的進化關(guān)系[6]。現(xiàn)代藥物化學研究表明，傘形科植物具有大量的揮發(fā)油、香豆素、三萜皂苷、生物堿等多種化學成分[7]。Suleimen et al.[8]采用高效液相色譜法，成功檢測到了33種揮發(fā)油成分，除此之外還含有少量香豆素。

葉綠體是植物進行光合作用的場所，是一種半自主復制的細胞器，具有單獨的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、相對獨立的遺傳信息，其結(jié)構(gòu)和遺傳信息在研究親緣關(guān)系方面具有重要的作用[9]。葉綠體基因組具有大小適中、便于測序，且在不同物種間有良好的共線性等特點，有利于基因組之間的比較分析[10]。近幾年，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，葉綠體基因組在多種藥用植物[11-16]的物種鑒定及分類、系統(tǒng)發(fā)育與進化、遺傳多樣性分析等方面得到了廣泛應用。

柳葉芹是一種重要的藥用植物。以往關(guān)于柳葉芹的研究，主要集中在描述其形態(tài)變異和化學成分方面；但對柳葉芹的分子和進化方面的研究減少。為此，本研究在依據(jù)本課題組前期對柳葉芹葉綠體基因組研究[17]的基礎上，以2020年5月31日采自黑龍江省伊春市的柳葉芹為試驗材料，利用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取基因組DNA，采用Illumina NovaSeq平臺進行高通量測序，得到柳葉芹完整的葉綠體基因組序列，分析柳葉芹葉綠體基因組組裝、序列特征、系統(tǒng)發(fā)育。深層次挖掘葉綠體基因組信息，對組裝后的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、長重復序列、簡單重復序列(SSR)位點、密碼子偏好性進行分析，并與其他傘形科植物共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。旨在為研究傘形科其他植物提供較為詳細、完善的資料，為該物種鑒定以及群體和個體水平的遺傳差異分析提供新的方法。

1 材料與方法

試驗材料：柳葉芹(Czernaevialaevigataturcz.)植物樣本，于2020年5月31日采自黑龍江省伊春市。取部分新鮮葉片用液氮處理，于超低溫低溫冰箱中-80 ℃保存；其余部分保存在黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院(標本號：YCL20200531T7)。

柳葉芹的DNA提取與高通量測序方法：使用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取的基因組DNA經(jīng)檢測合格后，用機械打斷的方法(超聲波)將DNA片段化；后對片段化的DNA進行片段純化、末端修復、3′端加A、連接測序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增形成測序文庫；建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina NovaSeq進行測序(測序由武漢貝納科技服務有限公司完成)。通過SOAPnuke軟件進行低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾。

柳葉芹的葉綠體基因組組裝、注釋與分析方法：使用測序數(shù)據(jù)拼接軟件(SPAdes)進行基因組拼接，利用序列比對軟件(blastn)將拼接結(jié)果與Czernaevialaevigata(MW284876)參考基因組進行比對分析比對，依據(jù)比對情況確定候選序列組裝結(jié)果。利用葉綠體基因組注釋軟件(PGA)[18]對柳葉芹葉綠體基因組注釋后并繪圖；運用葉綠體基因組邊界收縮擴張在線分析軟件(IRscope)對柳葉芹和同屬傘形科5個物種以及擬南芥葉綠體基因組進行比較分析；使用密碼子偏好性分析軟件(CodonW)對密碼子偏好性進行分析，統(tǒng)計估算相對同義密碼子的使用頻率；采用簡單重復序列分析軟件(MISA)[19]對葉綠體進行簡單重復序列(SSR)檢測。

柳葉芹葉綠體基因組系統(tǒng)進化分析方法：從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載傘形科6個物種的葉綠體基因組序列，分別是北柴胡[BupleurumchinenseDC.(MN893666)]、疏葉當歸[AngelicalaxifoliataDiels(NC_040122)]、林當歸[AngelicasylvestrisLinnaeus(MN275034)]、細苞藁本[LigusticumcapillaceumWolff(NC_049051)]、歐芹[Petroselinumcrispum(Mill.) Hill(NC_015821)]、擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.]葉綠體基因組(NC_000932)，并將其作為外類群參與系統(tǒng)進化分析。通過核苷酸序列多重比對軟件(MAFFT)，對上述7個物種葉綠體基因組序列進行多重比對，導出的比對序列利用系統(tǒng)進化分析軟件(MEGA 7.0)構(gòu)建鄰接樹；自舉檢測值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳葉芹葉綠體基因組基本特征

柳葉芹的葉綠體基因組呈現(xiàn)雙螺旋環(huán)狀結(jié)構(gòu)(見圖1)，基因組全長146 161 bp，包括2個反向重復序列(IRa區(qū)長度為17 422 bp、IRb區(qū)長度為17 422 bp)、1個大單拷貝區(qū)(LSC區(qū)長度為93 538 bp)、1個小單拷貝區(qū)(SSC區(qū)長度為17 779 bp)?；蚪M中包含有2個基因間隔(Gap)，DNA的4種堿基中鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比例(GC)為37.54%，組裝覆蓋度為224.3。

圖1 柳葉芹葉綠體基因組圖譜

2.2 柳葉芹葉綠體基因注釋、基因功能及分類

通過對柳葉芹葉綠體基因組進行注釋，共得到113個基因(見表1)，可將其分為4個大類：自身復制、光合作用、其它基因、未知功能。具有自我復制功能的基因共70個，參與光合作用的基因共33個基因，其它基因共5個，未知功能基因共5個。

表1 葉綠體基因組的基因

2.3 柳葉芹葉綠體基因組比較

柳葉芹與其他6種植物的LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa、IRa/LSC邊界及基因分布見圖2。柳葉芹與疏葉當歸、林當歸、細苞藁本的LSC/IRb的交界處，存在完整的ycl2基因。細苞藁本Ndhf基因，完整地存在于IRb/SSC交界處；而柳葉芹、疏葉當歸、林當歸的Ndhf基因，僅存在于SSC區(qū)一側(cè)，且距邊界11～22 bp。柳葉芹、疏葉當歸、林當歸3個物種在IRa區(qū)域含有完整的trnL基因，同時柳葉芹在該區(qū)域還有1個完整的ndhB基因，而在疏葉當歸、林當歸中不存在ndhB基因。

圖2 柳葉芹葉綠體基因組的反向重復區(qū)域和單拷貝區(qū)域邊界

2.4 柳葉芹葉綠體基因組長重復序列

所有的長重復序列包括3種類型，包括正向重復序列、回文重復序列、串聯(lián)重復序列，這些長重復序列具有促進葉綠體基因組重排的功能，并且可以增加其居群遺傳多樣性。在柳葉芹葉綠體基因組中，共發(fā)現(xiàn)5個正向重復序列、3個回文重復序列、4個串聯(lián)重復序列。其中1個回文重復序列較長(為17 422 bp)，是葉綠體基因組的反向重復區(qū)(IR)，其余重復序列長度較短(均在100 bp左右)。利用這些重復序列，可為后期開發(fā)種群進化標記提供研究基礎。

2.5 柳葉芹葉綠體基因組簡單重復序列

簡單重復序列，是由基因組中1到6個核苷酸組成的基本單位重復多次構(gòu)成的一段DNA序列，廣泛存在于基因組的各個區(qū)域，具有結(jié)構(gòu)簡單、相對保守等優(yōu)點，可用于遺傳多態(tài)性研究[20-21]。通過對柳葉芹葉綠體基因組的分析，共有205個簡單重復序列位點，包括：138個復雜重復類型，其數(shù)量最多；沒有單核苷酸重復類型；52個二核苷酸重復類型；2個三核苷酸重復類型；8個四核苷酸重復類型；1個五核苷酸重復類型。97.56%的簡單重復序列位點都含有腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)的堿基對，僅有5個簡單重復序列位點由鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)堿基對組成，說明腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)堿基對具有堿基偏好性。從堿基組成方面分析，這與柳葉芹葉綠體基因組中腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)堿基對比例較高(62.38%)相一致。

2.6 柳葉芹與同屬物種的親緣關(guān)系

葉綠體基因組的聚類分析，對植物發(fā)育進化研究具有重要意義。本研究選用5種已報道的傘形科植物葉綠體基因組，并以擬南芥的葉綠體基因組作為外類群，通過構(gòu)建鄰接樹(NJ-tree)，對柳葉芹進行進化分析，以確定其在傘形科植物中的進化位置(見圖3)。由圖3可見：不同科的植物分為不同的進化分支，6種傘形科植物聚在1個分支上，說明植物科間關(guān)系明確。在這個大的分支基礎上，柳葉芹與同屬物種聚到一支上，并且自展值為100，說明柳葉芹與同屬物種在漫長的進化過程中親緣關(guān)系最為接近。

圖3 依據(jù)柳葉芹和6個物種葉綠體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

葉綠體基因組大小一般在70～220 kbp之間，隨著物種的不同而不同[22-23]。已有研究表明，導致葉綠體基因組大小發(fā)生顯著變化的主要原因，是反向重復區(qū)的顯著擴張、收縮，甚至丟失。光合作用是影響反向重復區(qū)區(qū)大小的因素之一。有研究[24]表明，寄生植物的葉綠體基因組相對較小，主要是由于反向重復區(qū)區(qū)收縮導致的。葉綠體基因組通常含有100～120個編碼基因，其中蛋白編碼基因占總數(shù)80%以上，而tRNA、rRNA占比較少。在對葉綠體功能基因注釋的結(jié)果也能發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)的基因與光合作用以及基因轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)。因此，深入分析植物葉綠體基因組，有助于了解植物在光合作用過程中相關(guān)機制。

葉綠體基因組具有高度保守性，不易于重組，在一定程度上保留了植物的進化信息，因而在植物系統(tǒng)發(fā)育分析上，葉綠體基因組被認為是一個遺傳信息豐富、有價值的多層次的分類資源。本研究對柳葉芹葉綠體基因組進行測序及數(shù)據(jù)挖掘，通過分析發(fā)現(xiàn)，起轉(zhuǎn)錄翻譯作用和參與光合作用過程的基因，占被注釋到基因總數(shù)的91.15%，這與多數(shù)植物葉綠體基因組中基因功能一致。柳葉芹97.56%的簡單重復序列位點都含有腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)的堿基對，這與該物種葉綠體基因組整體腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)比例相一致。通過將柳葉芹與其它傘形科植物以及以擬南芥作為外類群植物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：柳葉芹與疏葉當歸的關(guān)系最為接近，支持率達100%。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)，對柳葉芹葉綠體進行測序，并進行了長重復序列、簡單重復序列位點、密碼子偏好性、近緣種葉綠體基因組比較、系統(tǒng)進化的分析。為傘形科植物研究提供了更為詳細、完善的資料，為該物種鑒定以及群體和個體水平的遺傳差異分析提供了新的方法。