蘇 進(jìn) 梅 君 鄭 洲 李云霄 周海波 許新華

(1. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 腫瘤科 & 三峽大學(xué) 腫瘤防治中心， 湖北 宜昌 443003; 2. 湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院 口腔科， 湖北 宜昌 443000)

鼻咽癌好發(fā)于我國華南地區(qū)，以同步放化療為主的非手術(shù)治療是其治療的主要手段，目前晚期鼻咽癌的治療效果仍不理想。近年來多項研究顯示，隸屬于黏附分子家族的白細(xì)胞分化抗原44(cluster of differentiation 44，CD44)，不僅在鼻咽惡性腫瘤中高表達(dá)，且廣泛參與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后[1]。

本研究擬采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)抑制CD44基因表達(dá)，并研究CD44在鼻咽癌細(xì)胞周期和凋亡方面的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

鼻咽癌SUNE-1 5-8F細(xì)胞購自中南大學(xué)高等研究中心細(xì)胞室；siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉瑪基因公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；兔抗人CD44單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；DEPC-Treated Water購自美國AmBion公司；碘化丙啶液購自美國Biolegend公司；Rnase A購自生工生物工程(上海)有限公司；light cycler 480 SYBR Green I Master購自瑞士Roche公司；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞的分組和轉(zhuǎn)染

根據(jù)siRNA系列分別命名為：NC組、實驗組(siRNA組)和空白對照組(Blank組)。Blank組為正常培養(yǎng)的SUNE-1 5-8F細(xì)胞，不轉(zhuǎn)染任何RNA。NC組和實驗組轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格參照Lipofectamine?RNAiMAX Reagent試劑盒說明書執(zhí)行。根據(jù)既往研究，采用Real-time qPCR檢測CD44 mRNA的表達(dá)，引物序列見表1，Western blot檢測CD44蛋白的表達(dá)[2]。

表1 引物序列表

1.2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期情況

預(yù)先配置DNA染液，將碘化丙啶液20 μL、Triton X-100 1 μL、Rnase Asolution 0.2 μL，加入PH 7.4的PBS定容至1 mL，混勻，4℃避光保存。收集細(xì)胞，制成終濃度為1×106個/mL的細(xì)胞懸液，離心去上清，加入1 mL -20℃保存的70%乙醇，渦旋振蕩使細(xì)胞分散，4℃固定過夜。離心棄上清，PBS清洗細(xì)胞2次，加入200 μL預(yù)先配好的DNA 染液，室溫避光孵育15 min，盡快上機(jī)檢測，計算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，PI(%)=[DNA合成(S)期細(xì)胞數(shù)+DNA合成后期(G2)細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞分裂(M)期細(xì)胞數(shù)]/[DNA合成前(G1)期細(xì)胞數(shù)+S期細(xì)胞數(shù)+G2期細(xì)胞數(shù)/M期細(xì)胞數(shù)]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況

借助Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞的上清液及清洗液， 0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，會同上述上清液及培養(yǎng)液一并離心，PBS洗滌2次，加入預(yù)先配好的1×Annexin V Binding液，制成終濃度為1×106個/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液100 μL，加入Annexin V-FITC結(jié)合物5 μL，碘化丙啶液5 μL，室溫避光孵育15 min；加入400 μL 1×Annexin V Binding液，1 h內(nèi)上機(jī)檢測，采用BeckmanCytExpert流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CD44 siRNA抑制細(xì)胞CD44 mRNA表達(dá)

Real-time qPCR檢測結(jié)果顯示，siRNA組鼻咽癌SUNE-1 5-8F細(xì)胞中CD44 mRNA下調(diào)達(dá)96.4%，較NC組、Blank組的表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖1。

注：與Blank組相比，*P<0.05；與NC組相比，#P<0.05圖1 Real-time qPCR檢測SUNE-1 5-8F細(xì)胞中CD44 mRNA的表達(dá)

2.2 CD44 siRNA抑制細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，siRNA組鼻咽癌SUNE-1 5-8F細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)下調(diào)達(dá)79.4%，較NC組、Blank組的表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖2。

注：與Blank組相比，*P<0.05；與NC組相比，#P<0.05圖2 Western blot檢測SUNE-1 5-8F細(xì)胞中CD44蛋白的表達(dá)

2.3 流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞周期分布情況

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與NC組和Blank組相比，siRNA組細(xì)胞中處于G0/G1期細(xì)胞的比例明顯升高(均P<0.05)；而S期細(xì)胞的比例明顯下降(均P<0.05)，見圖3。研究結(jié)果表明，CD44 siRNA抑制鼻咽癌SUNE-1 5-8F細(xì)胞增殖，使細(xì)胞生長阻滯于G0/G1期。

注：與Blank組相比，*P<0.05；與NC組相比，#P<0.05圖3 CD44 siRNA對SUNE-1 5-8F細(xì)胞周期的影響

2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示siRNA組、NC組、Blank組的凋亡率分別為8.62%、4.53%和4.35%；siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯高于NC組和Blank組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4。該結(jié)果表明，下調(diào)CD44的表達(dá)可以誘導(dǎo)SUNE-1 5-8F細(xì)胞凋亡。

注：與Blank組相比，*P<0.05；與NC組相比，#P<0.05圖4 CD44 siRNA對SUNE-1 5-8F細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

CD44通過多種途徑廣泛參與細(xì)胞-細(xì)胞/基質(zhì)間黏附、細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及淋巴細(xì)胞歸巢等重要功能。CD44過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[3]。近年研究表明，調(diào)控腫瘤細(xì)胞中CD44基因的表達(dá)可影響細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡、放化療敏感性等生物學(xué)特性。Günthert等[4]報道，轉(zhuǎn)染CD44后的淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯提高。張映城等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CD44+MKN-45胃癌細(xì)胞較CD44-細(xì)胞擁有更強(qiáng)的侵襲和增殖力、更易成瘤及轉(zhuǎn)移。胡琛等[6]發(fā)現(xiàn)，CD44的表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，且CD44可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程影響其轉(zhuǎn)移能力。Lun等[7]報道，CD44+NPC細(xì)胞較CD44-細(xì)胞對化療藥物更具抵抗性，具有更高的克隆形成率。我們的前期研究亦證實，CD44+鼻咽癌細(xì)胞具備高增殖能力、高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物、放化療抵抗等特性[8]。

現(xiàn)有眾多研究報道，沉默或減弱CD44基因表達(dá)可抑制胃癌[9]、乳腺癌[10]、膽囊癌[11]、喉癌[12]、腦膠質(zhì)瘤[13]、骨肉瘤[14]等細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。劉彥平等[15]報道，特異性CD44 siRNA可有效逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02的多藥耐藥性。Wang等[16]報道，CD44v6基因敲低可通過促進(jìn)凋亡和抑制自噬來增強(qiáng)HT29細(xì)胞的化學(xué)敏感性。胡楊麗等[17]亦報道，敲減CD44可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死，降低細(xì)胞侵襲力。另有學(xué)者報道[18]，通過下調(diào)人EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞株中CD44表達(dá)，可減弱EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加H460細(xì)胞對順鉑的化療敏感性，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在本研究中，CD44 siRNA抑制鼻咽癌SUNE-1 5-8F細(xì)胞增殖，使細(xì)胞生長阻滯于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，實驗結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，其具體機(jī)制有待更深層次的研究。另外，siRNA沉默CD44表達(dá)后，對細(xì)胞遷移、侵襲及放化療敏感性等其他生物學(xué)特性的影響也值得我們進(jìn)一步探索。