蔡 爽 鄭麗端

(華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 病理科， 湖北 武漢 430022)

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率高居惡性腫瘤第5位，其死亡率位于所有癌癥死亡的第4位[1]。在胃癌的前期研究工作中，我們將目光聚焦于c-MYC這一重要原癌基因。c-MYC是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(basic helix-loop-helix-leucine Zipper, bHLH-LZ)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在多種腫瘤中高表達(dá)，參與機(jī)體內(nèi)多種生物過程[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)c-MYC可參與調(diào)控自噬，在骨肉瘤中，MYC通過自噬途徑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖[4-5]。自噬是一種機(jī)體內(nèi)存在的動(dòng)態(tài)過程，可驅(qū)動(dòng)受損或不需要的物質(zhì)遞送至溶酶體中進(jìn)行降解[6]。此外，自噬通過提供循環(huán)營養(yǎng)和能量來促進(jìn)腫瘤發(fā)展[7]。本研究旨在探討c-MYC對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲功能的影響及其在自噬中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

AGS人胃腺癌細(xì)胞系來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，具有短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)細(xì)胞鑒定報(bào)告。

1.1.2 試劑

RPMI-1640完全培養(yǎng)基(美國Thermo公司)；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基粉末(美國Gibco公司)；青-鏈霉素雙抗溶液(美國Thermo公司)；胎牛血清FBS(美國 Thermo公司)；PBS緩沖液(谷歌生物科技有限公司)；胰蛋白酶(谷歌生物科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(谷歌生物科技有限公司)；TRIzol RNA分離試劑(美國Thermo公司)；PrimeScript TM RT Master Mix試劑盒(Takara 生物技術(shù)有限公司)；2×Taq Master Mix(南京Vazyme生物科技股份有限公司)；PVDF膜(美國Thermo公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；Neofect細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(零客創(chuàng)智生物科技有限公司)；Matrixgel(美國BD公司)；抗體(武漢ABclonal生物科技有限公司)；DAPI熒光染料(塞維爾生物科技有限公司)。本研究引物均由武漢擎科生物公司合成(表1)。

表1 實(shí)時(shí)引物名稱及序列

1.1.3 質(zhì)粒

人c-MYC真核表達(dá)質(zhì)粒(Lenti-CV186-c-MYC)、RNA干擾質(zhì)粒(Lenti-GV298-sh-c-MYC)、過表達(dá)質(zhì)?？蛰d(Lenti-CON294)、敲低質(zhì)?？蛰d(Lenti-GV298-sh-Scb)、LC3-Cherry-EGFP質(zhì)粒(pmCherry-EGFP-LC3B-h)均購于上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的收集

收集武漢協(xié)和醫(yī)院2021年9月～2021年10月收治的8例胃癌患者的胃癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)本院病理科診斷為胃癌。胃癌組織標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本(距腫瘤邊緣>5 cm處為準(zhǔn))離體后立即置入液氮中，保存?zhèn)溆谩１狙芯恳淹ㄟ^華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會(huì)審核。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含1%青-鏈霉素溶液，10% FBS)，于37℃恒溫、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。AGS細(xì)胞長(zhǎng)滿至T25培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)，胰蛋白酶消化至細(xì)胞成單個(gè)圓形，等體積培養(yǎng)基終止消化，并將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，觀察細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染體系配制：2 μg質(zhì)粒，2 μL Neofect轉(zhuǎn)染試劑，100 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，混勻，靜置20 min，避免紫外照射。轉(zhuǎn)染前2 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液處理，于6孔板中加入轉(zhuǎn)染體系，可將6孔板十字法搖晃混勻。靜置培養(yǎng)箱中48 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光情況，并開始進(jìn)行嘌呤霉素篩選，從而獲得穩(wěn)定的c-MYC過表達(dá)細(xì)胞株及敲低細(xì)胞株。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將使用此穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.2.3 Western blot

刮取穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，1 000 rpm×5 min離心收集細(xì)胞，棄上清后，向沉淀中加入1∶1體積的蛋白裂解液(RIPA)，冰上靜置5 min，超聲裂解30 s。BCA法測(cè)定蛋白濃度，以每孔30 μg計(jì)算上樣量。80 V恒壓電泳至蛋白Marker分開，上調(diào)電壓至110 V，繼續(xù)電泳約1.5 h至可分開目的條帶。切取所需目的條帶，剪裁大小適宜的PVDF膜，覆蓋在膠條上，避免氣泡。恒流300 mA濕法轉(zhuǎn)膜1 h；5%濃度的脫脂牛奶室溫封閉1 h，減少非特異性條帶的干擾；一抗室溫?fù)u床孵育4 h，二抗室溫孵育1 h，使用UVP凝膠成像儀曝光成像。內(nèi)參選用β-actin，蛋白分子量大小為43 kDa。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用TRIzol試劑提取樣品總RNA，并立即將其逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，qRT-PCR的反應(yīng)體系按說明書配制，于PCR反應(yīng)板上樣后上機(jī)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性，5 min；95℃變性，10 s；55℃退火，10 s；72℃延伸，根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度調(diào)整延伸時(shí)間；循環(huán)重復(fù)擴(kuò)增35次；內(nèi)參為β-actin，結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析。

1.2.5 MTT檢測(cè)

將狀態(tài)良好的AGS穩(wěn)篩細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每個(gè)分組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)更換細(xì)胞培養(yǎng)基(24 h、48 h、72 h以及96 h)，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱中孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔中培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩10 min，操作注意避光。立刻使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度，計(jì)算每組吸光度平均值。

1.2.6 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)(Soft Agar Assay)

2×RPMI-1640(2%抗生素，無血清)和低溶點(diǎn)瓊脂糖(1.2%)等體積混勻，6孔板的每個(gè)孔中加入3 mL，室溫靜置凝固形成下層膠。2×RPMI-1640培養(yǎng)基(2%抗生素，20%胎牛血清)和低溶點(diǎn)瓊脂糖(0.5%)等體積混勻，冷卻至35℃左右，加入200 μL細(xì)胞懸液(含細(xì)胞約2×103個(gè))，上下顛倒混勻，每組各取3 mL加入成型的下層膠之上。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆狀態(tài)，MTT溶液染色，并對(duì)克隆形成計(jì)數(shù)。

1.2.7 基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell)

24孔板每孔加入500 μL RPMI-1640培養(yǎng)基(含1%青-鏈霉素溶液，10%胎牛血清)，50 μL基質(zhì)膠包被Transwell小室，并將其放入含培養(yǎng)基的孔中。將200 μL無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液(含細(xì)胞約5×103個(gè))加入小室內(nèi)，靜置培養(yǎng)48 h。棄培養(yǎng)基，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色2 h。棉簽擦去上室細(xì)胞后，倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。每個(gè)小室在相同放大倍數(shù)下，拍取9個(gè)視野，并對(duì)每個(gè)視野下的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.8 自噬流檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，以適宜密度接種于24孔板(5×103個(gè)/孔)。LC3-Cherry-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，棄培養(yǎng)基，用甲醇固定細(xì)胞。用2 μg/mL DAPI染劑每孔200 μL進(jìn)行細(xì)胞核染色，染色時(shí)間為15 min。棄染劑后，防熒光淬滅封片劑封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察樣品。自噬流的量與自噬情況成正比。

1.2.9 公用數(shù)據(jù)庫分析

本研究使用了Kaplan-Meier Plot、BioGRID、Harmonizome等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析。其中通過BioGRID數(shù)據(jù)庫，我們得到自噬相關(guān)基因492個(gè)；使用Harmonizome數(shù)據(jù)庫找到c-MYC下游靶基因共1 102個(gè)；通過Kaplan-Meier Plot數(shù)據(jù)庫對(duì)ATG7進(jìn)行胃癌病例的生存分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異使用t檢驗(yàn)分析。皮爾遜相關(guān)系數(shù)測(cè)定法分析兩個(gè)基因之間的表達(dá)相關(guān)性。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-MYC在胃癌組織中高表達(dá)

對(duì)收集的胃癌組織和癌旁組織分別進(jìn)行了qRT-PCR和Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，相比于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，胃癌組織中c-MYC的表達(dá)明顯升高(見圖1A～1B)。

2.2 c-MYC促進(jìn)AGS胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲

采用空載質(zhì)粒(Mock)和c-MYC過量表達(dá)質(zhì)粒(c-MYC)轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞，并嘌呤霉素篩選，獲得了c-MYC過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。通過qRT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，c-MYC表達(dá)上調(diào)(圖2A、2B)。MTT和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，過表達(dá)c-MYC能明顯促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞的增殖(圖2C、2D)?；|(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，過表達(dá)c-MYC能明顯促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞的侵襲(圖2E)。

2.3 下調(diào)c-MYC抑制AGS胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲

用空載質(zhì)粒(sh-Scb)和c-MYC敲低的質(zhì)粒(sh-c-MYC#1、sh-c-MYC#2)轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞，并用嘌呤霉素篩選，獲得了c-MYC敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株。通過qRT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于sh-Scb組，sh-c-MYC#1和sh-c-MYC#2組中c-MYC表達(dá)明顯降低(見圖3A、3B)。MTT和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，下調(diào)c-MYC能明顯抑制胃癌細(xì)胞AGS的增殖(圖3C、3D)。基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，下調(diào)c-MYC能明顯抑制胃癌細(xì)胞AGS的侵襲(圖3E)。上述結(jié)果提示，c-MYC可能是胃癌發(fā)生發(fā)展中重要的促癌分子。

注：qRT-PCR(A)和Western blot(B)檢測(cè)胃癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm處為準(zhǔn))中c-MYC的表達(dá)水平。均以β-actin為內(nèi)參；1～8分別代表標(biāo)本1～8號(hào)組織；兩組相比較，*P<0.001圖1 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)胃癌及癌旁組織中c-MYC的表達(dá)水平

注：qRT-PCR(A)和Western blot(B)分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)c-MYC在AGS胃癌細(xì)胞中的過表達(dá)效率，以β-actin為內(nèi)參；MTT檢測(cè)c-MYC對(duì)AGS胃癌細(xì)胞增殖的影響(C)；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-MYC對(duì)AGS胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響(D)；基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-MYC對(duì)AGS胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響(E)。兩組間比較，*P<0.001圖2 過表達(dá)c-MYC對(duì)胃癌AGS細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

注：qRT-PCR(A)和Western blot(B)分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)c-MYC在AGS胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參；MTT檢測(cè)c-MYC對(duì)AGS胃癌細(xì)胞增殖的影響(C)；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-MYC對(duì)AGS胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響(D)；基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-MYC對(duì)AGS胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響(E)。兩組間比較，*P<0.001圖3 下調(diào)c-MYC對(duì)胃癌AGS細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

2.4 c-MYC調(diào)控自噬相關(guān)基因ATG7

c-MYC是研究較多的轉(zhuǎn)錄因子，能夠與多種蛋白相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[8]。我們通過BioGRID和Harmonizome數(shù)據(jù)庫[9]發(fā)現(xiàn)，c-MYC調(diào)控靶基因自噬相關(guān)蛋白7(autophagy related 7, ATG7)(圖4A)。通過KM曲線生存分析發(fā)現(xiàn)，高水平ATG7的死亡風(fēng)險(xiǎn)高于低水平ATG7(P<0.001)(圖4B)。在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中，通過qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)了ATG7在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的情況。與對(duì)照組相比，過表達(dá)c-MYC時(shí)，ATG7的水平明顯升高；反之，敲低c-MYC時(shí)，ATG7的水平明顯下降(見圖4C、4D)。由于ATG7與自噬聯(lián)系緊密，所以對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行了自噬流的檢測(cè)，結(jié)果如圖4E所示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)c-MYC組中自噬流明顯增加，而在敲低c-MYC時(shí)，自噬流明顯降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，c-MYC通過上調(diào)ATG7的表達(dá)從而促進(jìn)自噬。

3 討論

胃癌早期無明顯癥狀，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多為中晚期[10]。研究發(fā)現(xiàn)，目前接受手術(shù)治療的Ⅲ期胃癌患者的5年生存率為18%～50%[11]。這一數(shù)據(jù)表明現(xiàn)階段需要更有效的分子治療策略，來提高中晚期患者的5年生存率。

c-MYC是bHLH-LZ轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝和死亡，并且在多種腫瘤中高表達(dá)[2,12-13]。c-MYC可通過改變選定MYC抑制基因(MYC-repressed genes，MRG)轉(zhuǎn)錄物中的m6A修飾來抑制基因表達(dá)，從而促進(jìn)癌癥發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)c-MYC與CD44、CD24、乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)等乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物呈正相關(guān)，其可作為乳腺癌診斷和預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine tumor, pNET)中，c-MYC通過直接結(jié)合到血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGFC)啟動(dòng)子的E-box區(qū)域來上調(diào)VEGFC表達(dá)和pNET細(xì)胞的分泌[14-16]。此外，c-MYC還是一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠與多種蛋白相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[8]。

通過數(shù)據(jù)庫分析，我們發(fā)現(xiàn)了c-MYC的靶基因，自噬相關(guān)蛋白ATG7。ATG7是核心ATG蛋白，它通過脂化ATG8來驅(qū)動(dòng)經(jīng)典自噬降解[17]。研究發(fā)現(xiàn)ATG7擁有E1樣酶活性，在自噬過程中能夠驅(qū)動(dòng)磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)與LC3-I結(jié)合，產(chǎn)生LC3-II，促進(jìn)自噬過程[18]。ATG7還可調(diào)節(jié)P53活性，影響細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡[19]。c-MYC參與自噬過程早有大量報(bào)道。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶G9a通過直接和轉(zhuǎn)錄激活c-MYC來調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和自噬；MYC通過自噬途徑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖；在非小細(xì)胞腺癌中，c-MYC/miR-150/EPG5介導(dǎo)的自噬功能障礙有助于腫瘤的發(fā)展[5,20-21]。但在胃癌中，c-MYC與自噬相關(guān)蛋白ATG7的關(guān)系尚未有明確闡述。

注：將自噬相關(guān)基因與c-MYC靶基因進(jìn)行overlap分析(A)，分析得到在胃癌中生存有意義的靶基因ATG7(B)；qRT-PCR(C)和Western blot(D)分別檢測(cè)過表達(dá)c-MYC和c-MYC敲低的AGS細(xì)胞系中ATG7表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參；分別在過表達(dá)c-MYC和c-MYC敲低的AGS細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染LC3-EGFP-Cherry質(zhì)粒，共聚焦檢測(cè)自噬流的變化情況(E)；Scale bar值為10 μm。兩組間比較，*P<0.001圖4 胃癌細(xì)胞AGS中c-MYC對(duì)靶基因ATG7的調(diào)控作用

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)c-MYC能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。我們?cè)谖赴┡R床標(biāo)本上也進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明相較于癌旁組織，胃癌組織中c-MYC表達(dá)明顯增加。通過數(shù)據(jù)庫分析，我們發(fā)現(xiàn)ATG7是c-MYC所調(diào)控的靶基因，并且我們對(duì)這一結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)c-MYC正向調(diào)控ATG7的表達(dá)。ATG7與自噬關(guān)系密切，在自噬流檢測(cè)中可以發(fā)現(xiàn)過表達(dá)c-MYC會(huì)促進(jìn)自噬，而敲低c-MYC則會(huì)抑制自噬。由此，我們認(rèn)為c-MYC通過正向調(diào)控ATG7來影響自噬，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。