鄒拓 耿雷躍 張薇 杜琪 孟令啟 張啟星

（1 河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 唐山 063299；2 唐山市水稻育種重點實驗室，河北 唐山 063000；*第一/通訊作者：549282738@qq.com）

稻瘟病是水稻的主要病害之一，由真菌病原體（Magnaporthe oryzae）引起。1919年在印度首次發(fā)現(xiàn)稻瘟病，造成當(dāng)年水稻減產(chǎn)4%左右[1]。在隨后的稻瘟病發(fā)生過程中，僅僅在印度東部地區(qū)就造成水稻減產(chǎn)50%左右[2-3]。稻瘟病菌具有多樣性，以致一個抗病品種在生產(chǎn)上使用3~5年就喪失抗性[4-6]。有研究表明，全球每年由于稻瘟病造成的水稻減產(chǎn)量可以滿足6 000 萬人口的糧食需求，導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)50 億美元[7-8]。因此，篩選并應(yīng)用新的抗病種質(zhì)資源，有助于培育廣譜、持久的抗稻瘟病新品種。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的稻瘟病抗性基因被定位，在已定位的約100個稻瘟病抗性基因中有28個被成功克隆[9-10]。本研究中，利用Pi37、Pib、Pi9、Pigm、Pid3、Piz、Pi36、Pi5、Pia、Pikh、Pik 和 Pita基因的特異性分子標(biāo)記對參試粳稻資源進(jìn)行抗病基因型鑒定。其中，Pib 來自品種BL1，對日本大多數(shù)稻瘟病菌小種有抗性，對中國的菌株ZB13 和ZC15 也表現(xiàn)抗病反應(yīng)[11]；Pita 對稻瘟病菌菌株 ZN57 和 ZN61 表現(xiàn)抗病[12]；Pia 對江蘇省生理小種表現(xiàn)為強(qiáng)抗性[13]。

本研究中利用現(xiàn)有的粳稻資源，通過表型評價與基因型鑒定相結(jié)合的方式，分析基因型與其抗病反應(yīng)的關(guān)系，找到有效的抗病基因或聚合基因型，篩選到對本地區(qū)稻瘟病小種具有較強(qiáng)抗性的種質(zhì)資源，對今后抗稻瘟病水稻育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

共用到157 份粳稻材料，具體信息如表1。2019年4月至10月種植于河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所試驗基地。

表1 粳稻資源信息

1.2 實驗方法

1.2.1 抗病基因分子檢測

水稻分蘗高峰期取葉片樣品，存放至－20℃冰箱。水稻基因組DNA 的提取按上海植物生理研究所的TPS 抽提法稍加修改。Pi37、Pib、Pi9、Pigm、Pid3、Piz、Pi36、Pi5、Pia、Pikh、Pik 和 Pita 等 12個基因的引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物信息如表2，引物由北京擎科生物公司代為合成。PCR 的反應(yīng)體系總體積 20 μl，其中包括0.2 μl dNTP（10 mM），2.0 μl 10×PCR buffer（含 15 mM MgCl2），引物各 1.5 μl ，0.1 μl Taq 酶（5 U/μl），2 μl 材料基因組DNA，其余體積量由ddH2O 補(bǔ)齊。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸45 s；72℃，延伸5 min（括號部分為35個循環(huán)）。待溫度降至25℃，移至4℃冰箱待用。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段的分離，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照讀帶。

表2 抗稻瘟病基因分子標(biāo)記引物及擴(kuò)增片段信息

1.2.2 田間誘發(fā)稻瘟病鑒定

供試的 157 份材料于 4月20日播種，5月30日移栽，行株距20 cm×10 cm，每間隔10 份材料種植1 份麗江新團(tuán)黑谷并在鑒定圃周圍種植1 圈麗江新團(tuán)黑谷。鑒定圃內(nèi)防蟲不治病，增施氮肥，提高田間濕度，其余管理措施同大田。當(dāng)感病品種麗江新團(tuán)黑谷發(fā)病后確定稻瘟病誘發(fā)有效。7月26日至31日進(jìn)行田間葉瘟發(fā)病調(diào)查，8月20日開始調(diào)查穗瘟。調(diào)查方法及病級計算參照NY/T 2646-2014[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粳稻資源田間感病情況

據(jù)田間調(diào)查結(jié)果，在157 份材料中，表現(xiàn)為抗的2份、占比1.27%，中抗70 份、占比 44.59%，中感64 份、占比40.76%，感及高感共21 份、占比13.38%。可見，大多數(shù)種質(zhì)材料抗病綜合指數(shù)分布在中抗及中感水平間，表現(xiàn)為抗、感及高感的材料較少。參試材料中，葉瘟平均病級4.00，變異系數(shù)40.00%；穗瘟平均病級4.23，變異系數(shù)50.59%。

2.2 12個抗病基因的檢測結(jié)果

為明確不同基因型對本地區(qū)稻瘟病抗性表現(xiàn)情況，選擇抗性表現(xiàn)最好的和抗性表現(xiàn)最差的材料各20份，進(jìn)行抗稻瘟病基因分子檢測。通過比較表現(xiàn)極端的材料，找到材料中基因數(shù)量和基因型的差異與抗病性的關(guān)系。從圖1 可見，檢出頻率在15 次以上的有8個基因，其中Pid3 和Piz 基因檢出頻率最高，分別檢出40 次和34 次；檢出頻率在10 次以下的有4個基因，其中，Pi9 未檢出。

圖1 12個抗病基因的檢測情況

從表3 可見，40 份材料中，平均含有抗性基因5.2個；抗稻瘟病綜合指數(shù)表現(xiàn)為抗的材料中含有的抗病基因為5~8個，表現(xiàn)為感病的材料中，含有的抗病基因為2~5個。其中，ZY29 具有抗性基因最多，包含Pi5、Piz、Pik、Pikh、Pi37、Pid3、Pia、Pita 等 8個基因，抗病綜合指數(shù)為2.5，表現(xiàn)為中抗。ZY115 具有抗性基因數(shù)量最少，僅含Pi36、Pid3，抗病綜合指數(shù)為8.3，表現(xiàn)為高感。

2.3 材料抗性與基因型及基因數(shù)量的關(guān)系

通過對比抗病材料與感病材料的基因型看出（表3、圖2），抗病材料與感病材料相比，大多具有Pigm（5∶2）、Pia（18∶0）、Pita（5∶0）Pik（17∶4）、Pi5（12∶4）這 5個基因，括號中數(shù)字為具有此種基因抗病材料與感病材料的數(shù)量。由此可見，這5個基因在本地區(qū)對稻瘟病的抗病性起到一定作用。利用SPSS 對抗病基因數(shù)量與葉瘟病級進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表4）表明，材料中的抗病基因數(shù)量與稻瘟病綜合指數(shù)的相關(guān)系數(shù)為-0.844，在P=0.01 水平上達(dá)到負(fù)顯著性相關(guān)?？梢?，含有更多抗性基因的水稻材料具有更好的稻瘟病抗性。

圖2 抗病材料與感病材料在基因型上的差異

表3 40 份材料的基因型及抗稻瘟病綜合指數(shù)

表4 抗病綜合指數(shù)與抗病基因個數(shù)的相關(guān)性分析

2.4 種植資源在抗病育種上的應(yīng)用

從表 5 可見，ZY2、ZY13、ZY15 和 ZY21 等 4個種質(zhì)資源抗病性好，在株高、穗頸長、產(chǎn)量等性狀上能夠達(dá)到作為育種親本的要求。因此，育種者可利用這些材料通過分子標(biāo)記輔助選擇與常規(guī)育種手段相結(jié)合的方式，快速、準(zhǔn)確的選育聚合多個抗稻瘟病基因的新品種。

表5 抗病材料的農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀

3 討論

前人研究中，少有利用粳稻資源在冀東地區(qū)做稻瘟病抗性評價，而不同稻區(qū)稻瘟病生理小種自身也有高度的變異性，氣候條件也是影響稻瘟病發(fā)病的主要因素[22]。另外，病圃田間的誘發(fā)致病的生理小種是未知的混合小種, 而且不同位置的侵染菌種也可能不盡相同，加上小氣候差異等因素，所以田間誘發(fā)鑒定比人工接種鑒定的可靠性差些[23]。因此，本課題組利用157 份粳稻資源在河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所試驗基地進(jìn)行田間感病試驗，重點結(jié)合本地區(qū)生態(tài)環(huán)境及稻瘟病生理小種評價材料的抗病性，再結(jié)合分子標(biāo)記對抗病基因鑒定，挖掘在冀東地區(qū)表現(xiàn)高抗性抗病基因，為冀東地區(qū)抗病育種提供有效的基因供體。

本次用到的12個抗稻瘟病基因分布在第1、第2、第 6、第 8、第 9、第 11 和第 12 染色體上，全部已經(jīng)克隆，效應(yīng)及位點比較明確[9-10]。試驗中，用到的標(biāo)記大多為功能標(biāo)記。目前定位到的抗性基因除以上7 條染色體外，還存在于第4、第5、第7 和第10 染色體上，但其定位基因較少，未有基因簇的出現(xiàn)[24]。因此，本次選擇的基因具有一定的代表性和準(zhǔn)確性。

本研究中，通過對病級和抗病基因數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析，得到病級與基因數(shù)量成負(fù)向極顯著，因此聚合更多的抗性基因會提高品種的抗病性，這與張羽提出的稻瘟病抗性也屬于數(shù)量性狀，隨著抗性基因數(shù)目的增多，品種的抗病性呈上升趨勢一致[25]。

4 結(jié)論

對157份粳稻資源進(jìn)行稻瘟病抗性自然誘發(fā)鑒定，對稻瘟病表現(xiàn)為抗的有2 份、表現(xiàn)為中抗的有70份。結(jié)合稻瘟病基因檢測，對比抗病材料與感病材料基因型得到 Pigm、Pia、Pita、Pik、Pi5 等 5個對冀東地區(qū)稻瘟病有明顯抗病作用的抗性基因，且聚合的抗病基因越多，材料的抗病能力越高。進(jìn)一步結(jié)合農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀得到 ZY2、ZY13、ZY15 和 ZY21 這 4個種質(zhì)資源可作為抗稻瘟病育種中的抗病親本。