汪芹，紀(jì)小亭，黃鑫，曾東曉，秦安東，劉興祥

淮安市第四人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇淮安 223001

結(jié)核病是通過(guò)呼吸道傳播的一種傳染病，也是世界公認(rèn)的一種感染性疾病，仍是全球前10 位死因之一。結(jié)核病疫情嚴(yán)重[1]，中國(guó)位列全球第二，僅次于印度。調(diào)查顯示，2020 年全球登記的肺結(jié)核患者480 萬(wàn)例，其中59%為細(xì)菌學(xué)確診病例。2020 年全球診斷的580 萬(wàn)結(jié)核病患者中，只有33%（190 萬(wàn)/580 萬(wàn)）使用了分子方法檢查（2019 年全球登記結(jié)核病710 萬(wàn)）。近年來(lái)，由于結(jié)核病患者用藥不規(guī)范，初治或者反復(fù)治療，耐多藥結(jié)核病（multidrug resistance tuberculosis, MDR-TB）發(fā)生率越來(lái)越高。目前結(jié)核病診斷以及藥敏試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)仍是羅氏比例藥敏試驗(yàn)檢測(cè)法，但培養(yǎng)法的陽(yáng)性率低、時(shí)間長(zhǎng)[2]，使結(jié)核患者未得到及時(shí)有效的治療。利用新技術(shù)和更先進(jìn)的檢測(cè)設(shè)備如Xpert MTB/RIF、宏基因組二代測(cè)序[3]、DNA 微陣列[4]等可以及時(shí)有效的檢測(cè)出結(jié)核桿菌是否耐藥，成為結(jié)核病防治工作中當(dāng)務(wù)之急[5]，為臨床治療提供更可靠的治療依據(jù)。因此，本研究選取2019 年7 月—2022 年4 月淮安市第四人民醫(yī)院246 例肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，對(duì)比Xpert MTB/RIF 和比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平藥敏的臨床價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院住院或者門(mén)診肺結(jié)核患者痰液、肺泡灌洗液、胸水、組織液、膿分泌物、尿液、淋巴穿刺液和腦脊液等經(jīng)培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌為陽(yáng)性的246 份標(biāo)本，其 中 女67 例，男179 例；年 齡6～92 歲，平 均（48.8±20.6）歲。

1.2 方法

①改良羅氏比例法藥物敏感性試驗(yàn)。將收集的標(biāo)本經(jīng)過(guò)氫氧化鈉處理之后，接種于改良羅氏固體培養(yǎng)基上，常用羅琴培養(yǎng)基，由珠海貝索生物技術(shù)公司生產(chǎn)。將培養(yǎng)所得的純培養(yǎng)菌株作為受試菌株，用于結(jié)核桿菌藥敏檢測(cè)[6]，藥敏檢測(cè)步驟和結(jié)果報(bào)告按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》進(jìn)行。

②Xpert MTB/RIF。結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因和突變檢測(cè)（實(shí)時(shí)熒光PCR 法）試劑盒由美國(guó)Cepheid 公司（批號(hào)1000272355）生產(chǎn)，Xpert MTB/RIF試驗(yàn)按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行。GeneXpert 以半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)[7]為基礎(chǔ)，在結(jié)核分枝桿菌特有的序列rpoB 基因上81bp 利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR），專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)引物和5 條探針，檢測(cè)該序列是否發(fā)生突變，進(jìn)而判別是否檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌，再檢測(cè)其對(duì)利福平耐藥情況。敏感性=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，特異性=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；一致性計(jì)算kappa 值評(píng)定。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)利福平藥敏結(jié)果比較

246 例樣本分別經(jīng)Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平的耐藥率分別為14.6%（36/246）、11.4%（28/246），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.15，P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏檢測(cè)利福平藥敏結(jié)果

2.2 兩種方法檢測(cè)利福平藥敏結(jié)果符合情況比較

以改良羅氏比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)利福平耐藥的敏感性為100.0%（28/28），特異性為96.3%（210/218），符合率96.7%（238/246），兩種方法一致性較好（Kappa=0.86）。見(jiàn)表2。

表2 Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平藥敏符合率對(duì)比

2.3 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)利福平基因位點(diǎn)突變分布情況分析

Xpert MTB/RIF 檢測(cè)的246 份樣本中，檢測(cè)出36例利福平耐藥，Xpert MTB/RIF 針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的rpoB81bp 利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計(jì)引物及5 條 探 針，包 括ProbeA(507～511)、ProbeB(512～518)、ProbeC(518～523)、ProbeD(523～529)、ProbeE(529～533)，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)利福平耐藥位點(diǎn)主要以探針ProbeE（63.9%，23/36）為主，集中在位點(diǎn)529～533 之間，ProbeA 和ProbeB 兩個(gè)耐藥位點(diǎn)同時(shí)耐藥有2 例。見(jiàn)表3。

表3 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)利福平基因突變情況分析

3 討論

全球感染結(jié)核菌的人群中，絕大部分人感染結(jié)核分枝桿菌后因身體抵抗力較高而不會(huì)出現(xiàn)明顯的癥狀，即潛伏性結(jié)核感染，常用結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test, TST）進(jìn)行篩查[8]；少數(shù)人因免疫低[9]（如艾滋病、糖尿病患者）而出現(xiàn)相應(yīng)的結(jié)核臨床癥狀和病灶，即活動(dòng)性結(jié)核病。我國(guó)每年新發(fā)結(jié)核病人90 萬(wàn)，其中耐多藥結(jié)核患者約7 萬(wàn)，是高負(fù)擔(dān)結(jié)核病國(guó)家[10-12]，也是高負(fù)擔(dān)耐多藥結(jié)核病國(guó)家。利福平的單藥耐藥較少，據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，MDR-TB 患者中約82%為RR-TB 患者，所以利福平耐藥結(jié)核?。╮ifampicin resistance tuberculosis,RR-TB）[13]可作為耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）的標(biāo)志物[14-16]。所以在高科技發(fā)展的時(shí)代，利用新技術(shù)及時(shí)有效檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥性是重中之重。

本研究結(jié)果中，比例法藥敏試驗(yàn)顯示敏感而XpertMTB/RIF 顯示耐藥有8 例，原因可能是收集的246 例標(biāo)本中MTB 檢測(cè)區(qū)的基因雖發(fā)生突變，但并沒(méi)有引起耐藥表型的改變。有研究指出，主要是因rpoB 基因突變導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌耐藥，基因突變導(dǎo)致編碼RNA 聚合酶異常突變[17]，導(dǎo)致空間構(gòu)象改變、氨基酸置換，導(dǎo)致利福平耐藥。比如，ropB 基因的533、531、526、522、516、513 或511 密碼子發(fā)生大部分突變，從而使大部分菌株有利福平的耐藥性，而密碼子507、508、517、521、523 或者532 發(fā)生突變的菌株，并不會(huì)導(dǎo)致比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核桿菌利福平的耐藥性。也有報(bào)道，患者感染混合菌株造成不同基因突變，這樣使利福平耐藥存在差別。

246 例患者標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果中，本研究未出現(xiàn)比例法藥敏試驗(yàn)?zāi)退?，而XpertMTB/RIF 敏感的病例。據(jù)報(bào)道，上述藥敏情況不符也有可能發(fā)生，原因可能為：①M(fèi)TB 耐藥是由其他耐藥機(jī)制而非基因突變導(dǎo)致的，細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性改變、細(xì)菌表達(dá)外排泵造成藥物的外排等。②MTB 耐藥可能由其他基因（非檢測(cè)區(qū)基因）的突變引起的。比如目前用基因法檢測(cè)inhA 和kaG 基因[18]的突變情況來(lái)判斷異煙肼是否耐藥，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，因inhA 和kaG 的基因突變產(chǎn)生的耐異煙肼MTB 只占到80%，還有20%可能與其他基因突變有關(guān)。

兩種方法檢測(cè)利福平是否耐藥可以指導(dǎo)臨床合理用藥，世界衛(wèi)生組織在2014 年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊(cè)》中指出利福平藥敏試驗(yàn)包括表型藥敏試驗(yàn)和基因型藥敏試驗(yàn)，任何一個(gè)方法發(fā)現(xiàn)耐藥都需要考慮耐藥的可能性，這是由于近年有報(bào)道表型藥敏試驗(yàn)為敏感，但ropB 基因突變導(dǎo)致耐藥，患者采用一線抗結(jié)核藥物治療時(shí)，治療結(jié)果是失敗或復(fù)發(fā)的，應(yīng)該使用二線抗結(jié)核藥物[19-20]。

Xpert MTB/RIF 是一種可以高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和檢測(cè)利福平耐藥性的方法，選擇結(jié)核分枝桿菌RRDR 作為檢測(cè)區(qū)域，在該序列區(qū)域發(fā)生突變超過(guò)95%，且集中于81bp 的核心區(qū)，而敏感株rpoB 核心區(qū)序列則基本一致。因此，rpoB 核心區(qū)突變能高度提示利福平耐藥。另外，由于rpoB 核心區(qū)兩側(cè)就是結(jié)核分枝桿菌特異性基因序列。因此，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)給臨床提供了快速用藥治療的可能。

綜上所述，由于抗結(jié)核藥的不規(guī)范使用或者反復(fù)治療致使結(jié)核分枝桿菌容易出現(xiàn)耐多藥性，結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)耐多藥的菌株在臨床肺結(jié)核病例中出現(xiàn)比較頻繁，給人類(lèi)帶來(lái)很大的危害。因此，應(yīng)該利用現(xiàn)代最先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)如Xpert MTB/RIF、DNA 微陣列、全基因組（WGS）測(cè)序技術(shù)等來(lái)檢測(cè)結(jié)核桿菌藥物敏感性，這樣能更及時(shí)有效地指導(dǎo)臨床合理用藥，避免耐藥菌株不斷的出現(xiàn)。完成2035 年終止結(jié)核的目標(biāo)。相對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法藥物敏感試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣等缺陷，XpertMTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)具備高靈敏度、高特異性、高集成化、高通量等特性。由于MTB 耐藥是由多種機(jī)制引起的復(fù)雜過(guò)程，單純的耐藥基因檢測(cè)并不能完全反應(yīng)MTB 的實(shí)際耐藥情況，所以在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)綜合考慮。