孫源昊，李文龍，代兵，于慧媛，常江

深圳市薩米醫(yī)療中心，廣東深圳 518118

下咽癌是原發(fā)于下咽部的惡性腫瘤，其形成于喉嚨底部組織，且95%以上為鱗狀細(xì)胞癌，患病部位從高到低依次為梨狀窩、環(huán)后區(qū)、咽后壁3 處[1]。國(guó)外調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)每年3 000 人被確診為下咽癌，男性患病率為女性患病率的5 倍，且患病早期無(wú)明顯癥狀，隨病情加重患者咽喉部出現(xiàn)聲嘶、頸部腫塊、貧血、消瘦等臨床表現(xiàn)，腫瘤侵犯頸部血管還可造成嚴(yán)重病質(zhì)表現(xiàn)，影響患者生存質(zhì)量[2-3]。鈣離子通路與癌癥關(guān)系密切，相關(guān)研究證實(shí)，通過(guò)抑制鈣離子可促使癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而調(diào)控細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的整個(gè)過(guò)程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)調(diào)控的胞外鈣離子內(nèi)流進(jìn)程（store-operated calcium entry, SOCE）[4-5]。STIM1 基因是SOCE 輸入過(guò)程中的關(guān)鍵基質(zhì)，對(duì)癌癥細(xì)胞調(diào)控生長(zhǎng)生存尤為重要，相關(guān)研究表明STIM1 是致癌基因，其在食管癌、宮頸癌中高表達(dá)[6-7]。但當(dāng)前尚無(wú)確切研究證實(shí)STIM1 在下咽癌中表達(dá)情況及生物學(xué)水平變化?；诖?，本文選取2020 年3 月—2022 年3 月期間深圳市薩米醫(yī)療中心耳鼻咽喉科收取的40 份咽癌患者細(xì)胞作為培養(yǎng)對(duì)象，著重分析STIM1 在人下咽癌FaDu 細(xì)胞中的表達(dá)及凋亡情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于本院就診的40 份下咽癌患者細(xì)胞作為培養(yǎng)對(duì)象，通過(guò)培養(yǎng)人下咽癌細(xì)胞系FaDu 細(xì)胞，分為兩組，各20 份。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)常規(guī)X 線檢查后梨狀窩密度增高、椎前軟組織明混增厚，氣管推向前，聲帶及室?guī)ё冃巍?/p>

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①培養(yǎng)對(duì)象符合下咽癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②研究對(duì)象細(xì)胞符合《2016 英國(guó)國(guó)家多學(xué)科指南：下咽癌》診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；③培養(yǎng)基符合《中國(guó)藥典》2010版和《哺乳類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基》（HG/T 3935-2007）標(biāo)準(zhǔn)[9]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①培養(yǎng)對(duì)象資料不完整；②細(xì)菌數(shù)＜200；③細(xì)胞數(shù)量培養(yǎng)72 h 后低于1×108cells/mL；④細(xì)胞形態(tài)變異。

1.4 方法

①培養(yǎng)基：首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，選取定量培養(yǎng)基，通過(guò)液氮對(duì)下咽癌FaDu 細(xì)胞進(jìn)行迅速解凍，并在離心后去上層清液，將培養(yǎng)液放入含有青鏈霉素和胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37℃、5% 二氧化碳中。

②慢病毒感染：對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞混懸液進(jìn)行慢病毒感染，將生成混懸液置入6 孔板內(nèi)，放置于37℃、5%的二氧化碳中，直至細(xì)胞融合度＞30%，根據(jù)細(xì)胞原始數(shù)據(jù)適當(dāng)添加病毒，12 h 后觀察評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞未出現(xiàn)明顯毒性作用，需進(jìn)行二次培養(yǎng)，時(shí)間延長(zhǎng)至24 h 后更換培養(yǎng)基，若細(xì)胞出現(xiàn)毒性作用，應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)基，感染3 d 后觀察培養(yǎng)基基因表達(dá)情況，細(xì)胞感染后進(jìn)行詳細(xì)記錄。

③細(xì)胞增殖：對(duì)照組為常規(guī)空白組，添加適量BrdU，且實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)須加入，檢測(cè)前加入試劑，以1:100 比例進(jìn)行稀釋，稀釋后適量添加試劑進(jìn)行培養(yǎng)。

④細(xì)胞凋亡：采用D-Hanks 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單次沖洗，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，培養(yǎng)上清終止消化，收集細(xì)胞后存于離心管內(nèi)，各組設(shè)定3 個(gè)復(fù)孔，采用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）進(jìn)行沖洗沉淀離心，離心后收集細(xì)胞，添加5μl annexin V-APC 染色，基于常規(guī)溫度下避開(kāi)陽(yáng)光照射，10 min 后轉(zhuǎn)移到流式上機(jī)管中，進(jìn)行測(cè)驗(yàn)。

⑤細(xì)胞周期：細(xì)胞發(fā)育到80%時(shí)吸附舍棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗，經(jīng)胰酶消化細(xì)胞后停止培養(yǎng)，并將細(xì)胞放置于離心管內(nèi)設(shè)置復(fù)孔，離心后舍棄上清并應(yīng)用乙醇進(jìn)行細(xì)胞固定，固定后離心處理固定液，對(duì)細(xì)胞再次進(jìn)行沖洗沉淀，確保上機(jī)細(xì)胞通過(guò)率達(dá)到240 cell/s，將300 目細(xì)胞過(guò)濾篩網(wǎng)轉(zhuǎn)移至上機(jī)管內(nèi)進(jìn)行上機(jī)測(cè)試。

⑥細(xì)胞蛋白水平：對(duì)兩組培養(yǎng)基加入提前預(yù)冷的裂解液，在冰上裂解30 min，裂解后用超聲破碎細(xì)胞，4℃ 12 000 r/min 低溫高速離心15 min，棄沉淀，取上清，應(yīng)用Western blot 相關(guān)總蛋白分析試劑測(cè)量562 nm 處的吸光度，并作蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的吸光度-濃度曲線，對(duì)測(cè)得結(jié)果進(jìn)行比較。

1.5 觀察指標(biāo)

比較兩組病毒感染后蛋白水平表達(dá)及細(xì)胞凋亡、增殖、生長(zhǎng)能力情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞蛋白水平表達(dá)比較

STIM1 組蛋白水平表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞蛋白水平表達(dá)對(duì)比(±s)

表1 兩組細(xì)胞蛋白水平表達(dá)對(duì)比(±s)

2.2 兩組細(xì)胞凋亡、增殖、周期比較

STIM1 組細(xì)胞凋亡、增殖情況高于對(duì)照組，周期情況低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組細(xì)胞凋亡、增殖、周期對(duì)比[(±s),%]

表2 兩組細(xì)胞凋亡、增殖、周期對(duì)比[(±s),%]

2.3 兩組細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞增殖倍數(shù)比較

STIM1 組細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組，增殖倍數(shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞增殖倍數(shù)對(duì)比(±s)

表3 兩組細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞增殖倍數(shù)對(duì)比(±s)

3 討論

人下咽癌在臨床癌癥中發(fā)病率較低，但在頭頸腫瘤發(fā)病率中占據(jù)5%，且惡性程度較高，發(fā)病位置較為特殊，70%下咽癌患者確診時(shí)已為晚期，治療后預(yù)后效果欠佳[10]。國(guó)外針對(duì)下咽癌以手術(shù)和放療為主，早期下咽癌主要以根治性放療治療為主，在治療過(guò)程中患者生存率與根治性手術(shù)無(wú)差異，于20 世紀(jì)中期放療是治療下咽癌的主要手段，但隨醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，手術(shù)序貫放療治療出現(xiàn)，但當(dāng)前多數(shù)下咽癌患者就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，需給予手術(shù)放療綜合治療[11]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)針對(duì)下咽癌治療主要采取綜合治療方式，早期患者可經(jīng)口微創(chuàng)外科切除或進(jìn)行頸部清掃，包括對(duì)T1N0以及選擇性的T2N0 患者進(jìn)行保喉手術(shù)；對(duì)T1～3N0～3 和T4aN0～3 無(wú)器官功能保留需要的患者行全喉切除術(shù)；對(duì)T1～3N0～3 和T4aN0～3 在行誘導(dǎo)化療后原發(fā)灶小于PR 者，行手術(shù)治療；對(duì)行根治性放化療后殘存或復(fù)發(fā)的患者進(jìn)行手術(shù)治療[12]。對(duì)于需要保留喉功能的患者，多行手術(shù)聯(lián)合頸部清掃，并進(jìn)行放療或靶向治療，針對(duì)中晚期患者，多行手術(shù)治療聯(lián)合術(shù)后放療后，但術(shù)后患者仍需承受喉功能受損或喉功能喪失的痛苦。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)人下咽癌FaDu 細(xì)胞中STIM1 基因表達(dá)顯著，實(shí)驗(yàn)組凋亡的FaDu 細(xì)胞顯著提升，STIM1 基因在FaDu 細(xì)胞中顯著表達(dá)，且STIM1 蛋白表達(dá)同對(duì)照組相比明顯受到抑制[13-14]。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體基因調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的主動(dòng)過(guò)程，腫瘤與凋亡關(guān)系密切，腫瘤發(fā)生多數(shù)為凋亡受阻導(dǎo)致，當(dāng)腫瘤細(xì)胞凋亡能力被抑制，未能正常死亡，致使細(xì)胞數(shù)量增加[15]。通過(guò)體外慢性病毒感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，STIM1 沉默后，F(xiàn)aDu 增殖受到抑制且凋亡情況明顯提升，細(xì)胞周期被阻滯，細(xì)胞克隆能力降低，生長(zhǎng)情況減慢。STIM1 基因位于人類染色體11p15.5 區(qū)域，其編碼蛋白的分子量約為77 KDa，且在真核細(xì)胞中鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度改變及許多生理功能變化密切，蛋白質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜對(duì)鈣含量敏感，在細(xì)胞靜止時(shí)可檢測(cè)少量STIM1，同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下咽癌腫瘤細(xì)胞明顯受到STIM1 抑制，能影響腫瘤細(xì)胞增殖凋亡及周期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。STIM1 組下咽癌FaDu 細(xì)胞數(shù)量提升，同時(shí)STIM1 表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖，確保細(xì)胞周期停滯。結(jié)果顯示：STIM1 基因組細(xì)胞蛋白水平表達(dá)（0.75±0.23）低于對(duì)照組（0.96±0.21）；STIM1 組細(xì)胞凋亡、增殖情況高于對(duì)照組，周期情況低于對(duì)照組；STIM1 組細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組，增殖倍數(shù)低于對(duì)照組（P＜0.05）。宋殿芳等[16]的研究結(jié)果顯示，STIM1 組與空白對(duì)照組相比，STIM1-siRNA 組細(xì)胞侵襲能力以及PCNA、MMP-2、β-catenin、c-myc 的蛋白表達(dá)（0.63±0.15）均顯著降低，同本文結(jié)果相似，但本研究主要針對(duì)下咽癌進(jìn)行研究。

綜上所述，STIM1 基因?qū)ο卵拾┘膊aDu 誘發(fā)發(fā)展有一定影響，且進(jìn)一步了解STIM1 與下咽癌臨床癥狀的聯(lián)系，可發(fā)現(xiàn)STIM1 對(duì)下咽癌治療具有一定價(jià)值，下咽癌患病位置較為特殊，術(shù)后會(huì)影響患者交流、呼吸及生存質(zhì)量，因此STIM1 相關(guān)基因?qū)ο卵拾〧aDu 細(xì)胞基因具有影響作用，可作為下咽癌治療的新切入點(diǎn)。