江曼，朱日飛，陳雄，蘇美萍，邱琴，陶焓

1.香港中文大學(xué)（深圳）醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院）腫瘤科，廣東深圳 518172；2.香港中文大學(xué)（深圳）醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院）呼吸科，廣東深圳 518172

肺癌是我國癌癥死亡的首位病因，從2015 年至今，免疫卡控點抑制劑（immune checkpoint Inhibitors, ICI）的出現(xiàn)使免疫治療成為肺癌治療的新熱點[1]。以免疫卡控點抑制劑為代表的免疫治療，大多以提高T 細胞活力為手段，以達到抗腫瘤的目的。因此改善T 細胞的活力與功能是提高免疫治療腫瘤的重要策略。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）家族及其受體參與腫瘤新生血管的生成，同時還具有很強的免疫抑制功能[2-3]。VEGF 在促進腫瘤生長的同時，又通過抑制性免疫微環(huán)境使腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。

已有不少研究嘗試利用抗血管生成藥物逆轉(zhuǎn)免疫抑制，改善自身免疫系統(tǒng)的抗腫瘤能力。VEGFR2 抑制劑阿帕替尼被發(fā)現(xiàn)對T 細胞的活力具有調(diào)節(jié)作用，但具體分子機制尚不清楚[4-6]。經(jīng)典的T 細胞活化的信號通路主要由NF-κB，AP-1 及NFAT1 等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。其中NFAT1 的作用具有雙向性，在T 細胞的活化與耗竭中都起重要作用[7-8]。目前VEGF-VEGFR2-NFAT1 信號通路的研究主要側(cè)重于血管生成[9-10]，在T 細胞的中的作用則少見報導(dǎo)。VEGFR2 抑制劑阿帕替尼則下調(diào)T 細胞中NFAT1 的表達，使NFAT 維持低量表達，逆轉(zhuǎn)T細胞耗竭，促進T 細胞活化[11]。基于以上這些發(fā)現(xiàn)，本研究于2021 年1—10 月開展，探索VEGFR2抑制劑阿帕替尼在肺癌中對CD8+T 細胞功能影響的機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1 名健康志愿者外周血；平衡鹽溶液（hank's balanced salt solution, HBSS）；細胞分離液（percoll）（cytiva 公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基；10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（Gbico）；白介素-2（interleukin-2, IL-2)（北京義翹神州）；CD3（上海近岸生物，OKT3）；CD8+T 細胞磁選試劑盒（德國Miltenyi Biotec）；流式細胞儀（BD FACS Canto）；CD27 FITC，CD28-CY3，CD69-pre 流式抗體（北京義翹神州生物）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（Gbico）；CCK8（上海碧云天）；酶標儀（Tecan F50）；IL-2，IFN-γ，PD-1，LAG-3，TIM-3（北京義翹神州生物），NFAT1、CLTA-4（武漢云克隆生物）。

1.2 方法

①人外周血PBMC 細胞分離和CD8+細胞與細胞鑒定：肝素鈉抗凝管采集1 名健康志愿者外周血40 mL，使用HBSS 稀釋1 倍，使用cytiva 公司percoll人PBMC 分離（1：1），1 500 r/min 離心15 min，取中間層細胞即為PBMC 細胞，RPMI1640 培養(yǎng)基加10%FBS，5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

②T 細胞活化：6 孔板鋪種PBMC 細胞，細胞濃度106/mL，每孔2 mL，采用IL-2（20 ng/mL，北京義翹神州）和CD3（100 ng/mL，上海近岸生物，OKT3）誘導(dǎo)，第7 天CD8+T 細胞磁選試劑盒（德國Miltenyi Biotec）分離活化T 細胞。

③流式細胞儀（BD FACS Canto）檢測CD27 FITC，CD28-CY3，CD69-pre 表達（流式抗體均來自北京義翹神州生物），flowj 軟件分析數(shù)據(jù)。

④CCK8 檢測阿帕替尼對A549 細胞增殖的影響：A549 細胞培養(yǎng)采用高糖DMEM 培養(yǎng)基（Gbico），10%FBS（Gbico），5%CO2P/S 雙抗。使用CCK8（上海碧云天）檢測阿帕替尼對A549 增殖影響（100 μM，50 μM，25 μM，12.5 μM，6.25 μM，DMSO，BLANK）。具體方法：96 孔板每孔100 μl/5 000 個細胞；分別在24 h，48 h，72 h 檢測細胞擴增。每孔加入10 μl CCK8，37℃孵育4 h。酶標儀（Tecan F50）450 nm 波長檢測吸光值。

⑤72 h 收集上 清，ELISA 檢測CD8+T 細胞 中IL-2，IFN-γ，PD-1，LAG-3，TIM-3（北京義翹神州生物），NFAT1、CLTA-4（武漢云克隆生物）表達。分為3 組，分別為對照組（A），CD8T；激活組（B），CD8T+IL-2（20 ng/mL）+OKT3（100 ng/mL）；阿帕替尼組（C）：CD8T+IL-2（20 ng/mL）+OKT3 （100 ng/mL）+Apatinib（3 μM）。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布，以(±s)表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+細胞與細胞鑒定

人外周血細胞中，CD8 陽性率為25%，通過磁珠分選純化后純度提高到90%。見圖1。

圖1 純化前后CD8 陽性率

2.2 流式細胞儀檢測細胞因子表達

IL-2 和OKT3顯著促進CD28的表達（72.3±6.95）%，（86.2±2.40）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.30，P=0.030），對CD27表達的提高（80.4±3.99）%，（86.6±1.90）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.43，P=0.072）。IL-2，OKT3 和阿帕替尼協(xié)同顯著促進CD28（72.3±6.95）%，（96.2±1.92）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.75，P=0.005），CD27 的表達[（80.4±3.99）% vs （95.5±0.74）%，差異有 統(tǒng)計學(xué) 意義（t=-6.47，P=0.003）。3 組處理后CD69 的表達對比，[（73.2±3.40）% vs （73.0±1.90）% vs （72.5±2.63）%]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測細胞因子表達

2.3 阿帕替尼對A549 細胞增殖的作用

獲得24、48、72 h 這3 個時間點阿帕替尼對細胞增殖作用的數(shù)據(jù)，計算72 h 時的IC50，為后續(xù)用藥提供依據(jù)，最終選擇1/8 IC50 3 μM 為用藥濃度觀察細胞。見表1、圖3。

表1 不同時間點不同濃度阿帕替尼對細胞增殖的作用(±s)

表1 不同時間點不同濃度阿帕替尼對細胞增殖的作用(±s)

圖3 阿帕替尼對A549 細胞增殖的作用

檢測不同情況下CD8T 細胞對A549 的殺傷作用，IL-2 和OKT3 有助于淋巴細胞殺傷腫瘤細胞（27.6±2.23）%，（36.3±0.98）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.17，P=0.003）。IL-2，OKT3 和阿帕替尼協(xié)同可以顯著提高殺傷腫瘤細胞的水平[（27.6±2.23）% vs （44.8±1.53）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-10.98，P＜0.001）。見圖4。

圖4 CD8+T 細胞對A549 的殺傷作用

2.4 ELISA 檢測蛋白表達

IL-2和OKT3促進IL-2[（6.57±2.17）pg/mL vs （18 393.76±835.670）pg/mL]，INF-γ[（15.99±2.34）pg/mL vs （592.09±62.87）pg/mL]表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。IL-2，OKT3 和阿帕替尼協(xié)同促進IL-2[（6.57±2.17）pg/mL vs （22 367±1 368.69）pg/mL]，INF-γ[（15.99±2.34）pg/mL vs （689.60±32.05）pg/mL]的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.001。IL-2 和OKT3 抑 制PD-1[（41.99±6.24）pg/mL vs （24.92±1.30）pg/mL]，LAG-3[（58.34±5.56）pg/mL vs （43.35±2.32）pg/mL]，TIM-3[（16.62±1.7）pg/mL vs （10.64±0.59）pg/mL]表達，IL-2，OKT3 和阿帕替尼協(xié)同顯著抑制PD-1[（41.99±6.24）pg/mL vs （13.03±1.71）pg/mL]，LAG-3[（58.34±5.56）pg/mL vs （31.87±4.06）pg/mL]，TIM-3[（16.62±1.72）pg/mL] vs （4.92±1.36）pg/mL]的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。IL-2 和OKT3 抑制淋巴細胞表達NFAT1[（24.87±3.49)ng/mL vs （15.26±1.02) ng/m]，IL-2，OKT3和阿帕替尼協(xié)同抑制NFAT1[（24.87±3.49) ng/mL，（3.53±0.87)ng/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 ELISA 檢測蛋白表達

3 討論

ICI 的出現(xiàn)使免疫治療成為肺癌治療的新熱點，盡管目前存在免疫治療療效預(yù)測標記不十分明確、最佳組合方式及治療時機有待進一步探索等問題，但其在部分患者中所展現(xiàn)的療效較值，證明肺癌免疫治療的探索是進一步改善患者預(yù)后的關(guān)鍵所在。

惡性腫瘤免疫逃逸是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因之一，具體的機制包括：腫瘤抗原表達的下降或缺失、抑制性的免疫微環(huán)境及T 細胞的老化、失能與耗竭等。T 細胞的失能以其擴增能力下降及IL-2 表達減少為主要特征；T 細胞耗竭以抑制性受體PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、BTLA 及TIGIT 的表達上調(diào)為主要特征，同時伴隨IL-2，IFN-γ，TNF-α，及granzyme B 的表達下調(diào)[12]。本研究以抗血管生成藥物阿帕替尼協(xié)同IL-2 及OKT3，可以明顯促進IL-2及INF-γ 的表達，抑制PD-1、LAG-3、以及TIM-3 的表達，證明這一策略可以改善T 細胞的活力與功能，是避免惡性腫瘤免疫逃逸的有效方法。

VEGF/VEGFR2 通路是促進血管生成的主要調(diào)節(jié)者。我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型抗血管生成藥物VEGFR2 抑制劑阿帕替尼，能特異性結(jié)合VEGFR2，繼而抑制VEGF 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，降低腫瘤微血管的形成。既往研究還證實VEGF 同時還具有很強的免疫抑制功能。VEGF/VEGFR 通路可抑制效應(yīng)T 細胞的分化與功能；抑制DC 的分化及活化；促進包括Treg、MDSC、TAM 等抑制性免疫細胞的募集。已有不少研究嘗試利用抗血管生成藥物逆轉(zhuǎn)免疫抑制，改善自身免疫系統(tǒng)的抗腫瘤能力。對于免疫系統(tǒng)中主要起腫瘤殺傷作用的CD3+、CD8+T 細胞而言，抗血管生成藥物主要從以下3 個方面來提高T 細胞的抗腫瘤功能：①促進血管正?；?，增加T 細胞的腫瘤浸潤[13-14]。②減少抑制性免疫細胞比如Treg 及MDSC 細胞的數(shù)量與局部募集[15-16]。③直接作用于T 細胞，逆轉(zhuǎn)T 細胞功能耗竭?，F(xiàn)有的研究主要側(cè)重于抗血管生成藥物的血管正?；皩σ种菩悦庖呒毎饔?，而第3 種對T 細胞的直接作用則較少報導(dǎo)。本研究較好地驗證了阿帕替尼通過上調(diào)CD3+、CD8+T 細胞的IL-2 及IFN-γ 的表達；下調(diào)免疫卡控點抑制性分子比如PD-1、LAG-3、TIM-3 的表達，并提高T 細胞的體內(nèi)外胃癌腫瘤細胞殺傷功能，逆轉(zhuǎn)T 細胞的失能與耗竭，促進T 細胞的活化的作用。

經(jīng)典的T 細胞活化的信號通路主要由NFκB，AP-1 及NFAT1介導(dǎo)。其中NFAT1的作用具有雙向性，在T細胞的活化與耗竭中都起著重要作用，同時NFAT1 又是VEGFR2 通路的下游的轉(zhuǎn)錄因子之一。目前VEGF-VEGFR2-NFAT1 信號通路的研究主要側(cè)重于血管生成，在T細胞的中的作用則罕見報道，本研究的結(jié)果有力地證明這一信號通路在。還有研究發(fā)現(xiàn)VEGF 在也可誘導(dǎo)T細胞內(nèi)NFAT1 的大量表達，促進T 細胞的失能與耗竭，VEGFR2 抑制劑阿帕替尼則下調(diào)T 細胞中NFAT1 的表達，使NFAT維持低量表達，逆轉(zhuǎn)T細胞耗竭，促進T 細胞活化。既往研究證實NFAT1的表達完全缺失可導(dǎo)致T 細胞的完全失能，再刺激后基本不再表達IL-2 或IFN-γ，且NFAT:AP-1復(fù)合體結(jié)合至靶基因的能力要優(yōu)于NFAT 單體[17-18]。本研究同樣驗證了這一理論，即VEGFR2抑制劑阿帕替尼逆轉(zhuǎn)T 細胞失能與耗竭的關(guān)鍵在于誘導(dǎo)NFAT1 的低量表達；NFAT1 低量表達時，主要發(fā)揮激活靶基因IL-2 表達、減少免疫耗竭失能相關(guān)的靶基因表達的作用，減少T 細胞失能與耗竭，促進T 細胞的活化。

本研究結(jié)果的意義在于：①探尋抗血管生成治療療效相關(guān)的關(guān)鍵分子，評估其臨床預(yù)測作用；②探索抗血管生成藥物對T 細胞功能影響的關(guān)鍵分子；③進一步明確T 細胞活力的影響因素，為尋找干預(yù)T 細胞活力的新靶點奠定基礎(chǔ)，尋求提高過繼性免疫細胞治療療效新策略；④為抗血管生成治療與免疫治療比如PD-1 抗體的聯(lián)合應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。