羅寧 李惠霞 劉永剛 李煥宇 楊順義 李金章 石明明 李金鴻

摘要 為探討甘肅隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲田間侵染動態(tài)，于2017年-2019年對大豆根系和根際土壤定期定點取樣，采用漂浮法、貝曼漏斗法及酸性品紅染色法對土樣中和根組織內線蟲進行分離計數(shù)，研究其繁殖數(shù)量與氣溫、降雨量的關系。結果表明，2017年土壤中2齡幼蟲和新鮮孢囊的數(shù)量有3個明顯高峰，大豆根組織內2～4齡幼蟲均出現(xiàn)3個明顯高峰，即發(fā)生3代，平均世代歷期35 d。2018年-2019年土壤中2齡幼蟲和新鮮孢囊均有4個明顯高峰，大豆根組織內2～4齡幼蟲亦出現(xiàn)4個明顯高峰，即發(fā)生4代。第1代侵染數(shù)量最多，是主要危害世代。最后1代侵染數(shù)量極少且發(fā)育緩慢。在2017年-2019年生長季中，線蟲繁殖數(shù)量與生長季平均溫度具有相關性，與累積降雨量無相關性。

關鍵詞 大豆; 大豆孢囊線蟲; 侵染特征; 世代循環(huán)

中圖分類號： S435.651

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021019

Abstract In order to explore the infection dynamics of soybean cyst nematode in the soybean field in east of Gansu province， soil and root samples were periodically collected from one fixed soybean block from 2017 to 2019. The nematodes were separated and counted under microscope by floating， Baermann funnel and acid fuchsin staining method， and the relationship between the reproduction and temperature and humidity were investigated. The results showed that there were three distinct number peaks of 2nd stage juvenile and new cysts in the soil， and three peaks of the emergence of 2nd， 3rd and 4th juveniles in soybean roots， which occurred in three generations and the average period of one generation was 35 d in 2017. From 2018 to 2019， there were four distinct number peaks of 2nd stage juvenile and new cysts in the soil and four peaks of the emergence of 2nd， 3rd and 4th juveniles in soybean roots， indicating that four generations occurred. The first generation had the largest number of infections， which was the main damage period and nematodes developed slowly in last generation. During the growing season from 2017 to 2019， the number of nematodes reproduction was correlated with the average temperature， but not with the accumulated rainfall.

Key words soybean; Heterodera glycines; infection characteristics; generation cycle

大豆孢囊線蟲（soybean cyst nematode，SCN）屬側尾腺口綱墊刃目異皮科孢囊線蟲屬，是大豆生產(chǎn)中危害最嚴重的植物病原線蟲[1]。目前，在美國、加拿大、波多黎各、海地、阿根廷、巴西、巴拉圭、哥倫比亞、俄羅斯、比利時、英國、意大利、日本、韓國、朝鮮、伊朗、印度尼西亞和埃及等國家大豆種植區(qū)普遍發(fā)生[25]。我國23個省（自治區(qū)，直轄市）已有大豆孢囊線蟲分布[611]，其中在黃淮海和東北大豆產(chǎn)區(qū)危害尤為嚴重，每年危害面積超過267萬 hm2[12]，隨著大豆連作年限增加，病情逐年加重，嚴重者減產(chǎn)80%以上，甚至絕收。

據(jù)報道，大豆孢囊線蟲理論上1年可以繁殖6代，具體世代數(shù)主要受土壤溫度、寄主品種、播種時間和播種期等因素影響[13]。美國明尼蘇達州大豆孢囊線蟲1年發(fā)生3～4代[14]。俄羅斯阿穆爾州地區(qū)1年發(fā)生3代，平均歷期27.3 d[15]。在我國，黑龍江省1年發(fā)生3代，第1代發(fā)生量最大[16]，在山西、江蘇和河南等省1年發(fā)生4代[6]。同一地區(qū)不同生長季，大豆孢囊線蟲發(fā)生代數(shù)存在差異。研究顯示，大豆孢囊線蟲2013年在山東大豆上發(fā)生3代，2014年發(fā)生4代，第2代有明顯世代重疊現(xiàn)象[1314]。北京地區(qū)，大豆孢囊線蟲在地黃上1年發(fā)生5～6代[17]。目前，甘肅省大豆孢囊線蟲的侵染動態(tài)尚無研究。

甘肅省是西北地區(qū)大豆主產(chǎn)區(qū)之一，年種植面積維持在13.33萬～15.33萬hm2，其中隴東地區(qū)種植面積最大，達10萬hm2[18]，本課題組調查發(fā)現(xiàn)，隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲發(fā)生嚴重，孢囊檢出率為87.2%，已成為該地區(qū)大豆生產(chǎn)的主要限制因素[19]。

在大豆生長季，孢囊線蟲的侵染次數(shù)與數(shù)量受多種因素影響，如寄主品種、氣溫和降雨量等均不同程度地影響大豆孢囊線蟲群體繁殖[2022]，另外耕作方法和土壤質地也會導致大豆孢囊線蟲群體變化[2325]。我國幅員遼闊，大豆種植區(qū)跨度大，甘肅與黑龍江、江蘇及山東等大豆產(chǎn)區(qū)氣候條件、大豆播種期均不同，大豆孢囊線蟲侵染規(guī)律與其他地區(qū)是否存在差異尚不明確。因此，本研究在2017年-2019年春播大豆生育期內對大豆孢囊線蟲群體變化動態(tài)進行系統(tǒng)研究，探究氣溫、降雨對其繁殖的影響，以期明確該地區(qū)大豆孢囊線蟲田間侵染規(guī)律，為大豆孢囊線蟲有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

大豆‘中黃30號’（市售），中感大豆孢囊線蟲病。

1.2 試驗地概況

試驗地位于甘肅省慶陽市寧縣良平鎮(zhèn)豐樂村（35°26′E，108°04′N），年平均氣溫8.7℃，無霜期168 d，年均降水量565.9 mm，降雨多集中在7月-9月，季節(jié)分配不均，屬于典型黃土高原半濕潤偏干旱氣候類型區(qū)[26]。試驗地連續(xù)多年種植大豆，孢囊線蟲基數(shù)較高，平均37.4個/100 g。分別于2017年5月1日、2018年5月2日和2019年5月5日播種大豆，播種后田間無人工灌溉，進行正常鋤草和噴藥管理。

1.3 取樣時間和方法

2017年5月15日至9月23日內共取樣14次，每間隔10 d左右取樣1次。2018年5月13日至9月21日內共取樣19次，2019年5月15日至9月20日內共取樣19次，每間隔6～8 d取樣1次。采用“ZigZag”取樣法，每次隨機選取10個樣點，每個樣點挖采大豆根系2～3株，保持根系完整，裝入取樣袋。每個樣點挖取根圍深度0～20 cm土壤作為1個小樣，將10個小樣裝入塑料袋混合作為1個樣品，約1 kg，帶回實驗室檢測。

1.4 線蟲的室內檢測

1.4.1 土壤中線蟲的分離

將土樣混合均勻后稱取100 g，采用漂浮法和貝曼漏斗法對孢囊和2齡幼蟲（J2）進行定量分離[27]，在60目篩上收集白雌蟲和孢囊，解剖鏡和顯微鏡下對孢囊和J2進行鏡檢和計數(shù)。

1.4.2 根組織中線蟲的染色和計數(shù)

將混合樣中的大豆根系清洗干凈剪成2～3 cm小段并稱重，采用酸性品紅對根組織進行染色[4]。在顯微鏡下對染色的2齡、3齡（J3）、4齡（J4）幼蟲和根組織內年輕雌蟲進行鏡檢、計數(shù)和拍照。

1.4.3 孢囊線蟲世代的劃分標準

依據(jù)土壤中J2、新鮮孢囊出現(xiàn)的高峰數(shù)及其時間間隔長短，同時參考根組織中J2、J3、J4和年輕雌蟲出現(xiàn)情況來確定大豆孢囊線蟲的世代。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計每100 g土壤中孢囊（白雌蟲和新鮮孢囊）和J2的數(shù)量，以及1 g根組織內J2、J3、J4和年輕雌蟲的數(shù)量，統(tǒng)計各蟲態(tài)發(fā)育動態(tài)。從當?shù)貧庀缶肢@取當年氣象數(shù)據(jù)，統(tǒng)計每個取樣周期間平均氣溫、平均最低氣溫、平均最高氣溫和累積降雨量。采用Excel 2010和SPSS軟件對各齡期群體動態(tài)、氣溫和降雨信息進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 土壤中大豆孢囊線蟲群體動態(tài)

2017年-2019年3個大豆生長季對土壤中孢囊線蟲J2和新鮮孢囊群體密度變化情況的觀察表明，100 g土壤中新鮮孢囊和J2數(shù)量的變化趨勢較為吻合，有輕微起伏（圖1）。2017年新鮮孢囊出現(xiàn)3個高峰，2018年-2019年新鮮孢囊出現(xiàn)3個明顯高峰和1個不明顯高峰。2017年-2019年新鮮孢囊數(shù)最高值分別出現(xiàn)在7月5日、7月4日和7月5日，100 g土中分別有26.7、31.0個和35.3個。9月中旬，新鮮孢囊數(shù)量持續(xù)減少，孢囊數(shù)量為1～5個。此外，在2018年6月6日發(fā)生高峰不明顯，孢囊數(shù)僅為5個。

2017年-2019年，土壤中J2群體數(shù)量變化見圖1。2017年土壤中J2數(shù)量共出現(xiàn)3個明顯峰值，時間為6月26日、7月16日和8月26日。7月16日J2密度最大，100 g土中有16.3條。生長季后期，J2群體密度逐漸降低，數(shù)量極少，100 g土只有2條。2018年-2019年，土壤中J2數(shù)量均出現(xiàn)4個明顯峰值，J2全年密度最大出現(xiàn)在7月4日和7月5日，為24.3條和28.0條，9月中旬土壤中J2發(fā)生水平低，僅為1～2條。

2.2 根組織中大豆孢囊線蟲群體動態(tài)

2017年-2019年大豆根組織中大豆孢囊線蟲 J2、J3和J4群體密度變化情況見圖2。2017年J2密度有3個明顯高峰，其中7月26日密度最大，1 g根系中有404條。J3和J4亦有3個明顯高峰，密度最高為1 g根中有105條、31條。9月5日-14日根組織中J3和J4密度極小，1 g根中僅有3條。2018年和2019年，J2侵染數(shù)量均有4個明顯高峰，分別在8月15日和7月25日J2數(shù)量最多，1 g根中分別有394條和312條。J3數(shù)量有4個明顯高峰，在7月24日和6月27日數(shù)量最多，1 g根中分別有115條和95條，持續(xù)時間較短。J4數(shù)量有4個明顯高峰，分別在7月11日和7月5日數(shù)量最多，分別為64條和45條。9月上旬以后根組織內雖然再次出現(xiàn)J3和J4，但密度極小，僅有2～4條。

2.3 大豆孢囊線蟲的世代循環(huán)

2017年-2019年，從6月上旬至7月上旬，土壤中J2與新鮮孢囊發(fā)生水平低，結合根組織中J2侵入量、J3和J4（圖3，b～e）形成量大幅增加可以推測基本完成第1代。第1代J2侵入速度慢，根組織中各齡幼蟲發(fā)育遲緩，數(shù)量多，世代周期長，約42 d。

2017年7月5日至9月6日，根組織中J2、J3和J4均出現(xiàn)2個高峰，表明基本完成第2、3代，歷期分別為32 d和30 d。第1代和第2代內各蟲態(tài)發(fā)生高峰順序與土壤中J2→根組織中J2、J3、J4→新鮮孢囊不相符，表明前2代存在較為明顯的世代重疊現(xiàn)象。第3代根內J3、J4發(fā)育緩慢且數(shù)量極少，土壤中J2與新鮮孢囊數(shù)量呈下降趨勢，說明第3代發(fā)育不完全。因此，2017年大豆孢囊線蟲發(fā)生3代。

2018年和2019年，從7月上旬至8月上旬，土壤中J2、根組織中各齡幼蟲與新鮮孢囊在不同時期發(fā)生不同程度的高峰，表明基本完成第2代，歷期28 d，根組織中J2、J3、J4發(fā)育較慢、世代周期較長。第1代和第2代內各蟲態(tài)發(fā)生高峰的順序并不規(guī)律，表明前2代存在較為明顯的世代重疊現(xiàn)象。第3代于8月下旬土壤中J2，根組織內J2、J3、J4數(shù)量達到高峰，且土壤中產(chǎn)生大量新鮮孢囊，該世代歷期21 d基本完成，J2侵入速度快，根組織中幼蟲發(fā)育快且世代發(fā)生比較整齊。直至9月中旬根組織內J2侵染數(shù)量達到高峰，但根內J3、J4發(fā)育減慢，數(shù)量極少，土壤中J2出現(xiàn)峰值，完成第4代，歷期23 d。之后雖然在土壤中能檢測出少數(shù)J2，但對根組織的侵染基本停止。因此，2018年和2019年大豆孢囊線蟲發(fā)生4代。

每代根組織內J4膨大突出根部表皮，進一步發(fā)育為成熟雌蟲（圖3，f～g），雌蟲在體內產(chǎn)卵。 后期雌蟲死亡，體壁漸漸增厚，形成褐色、檸檬形的孢囊（圖3h）脫落到土壤中。孢囊中的卵粒（圖3a）存活時間長。由此可見，大豆孢囊線蟲每年第1代侵染時間基本一致，但在6月下旬后，因田間溫度和降雨量影響，大豆孢囊線蟲侵入和發(fā)育速率發(fā)生變化，2018年和2019年第2、3、4代歷期較短。

2.4 溫度和降雨對大豆孢囊線蟲繁殖的影響分析

該地區(qū)在大豆整個生長季無人工灌溉，因此氣溫是影響大豆孢囊線蟲繁殖的主要因素。用SPSS軟件做Spearman相關分析，結果表明，平均溫度與J2、J3、J4數(shù)量的Spearman相關系數(shù)分別為0.747、0.737、0.608 （P<0.001），說明平均溫度（℃）和線蟲數(shù)量（條）存在正相關關系，即平均溫度升高與線蟲繁殖數(shù)量有關（表1）。而累積降雨量與J2、J3、J4數(shù)量的Spearman相關均為P>0.05，說明累積降雨量（mm）和線蟲數(shù)量（條）不存在相關關系，可能和降雨量不均勻有關。

3 討論

大豆孢囊線蟲在20～28℃內隨溫度升高而發(fā)育速度加快，28℃為最適發(fā)育溫度，高于33℃幾乎不能發(fā)育[27]。在甘肅隴東，氣象數(shù)據(jù)表明，2017年7月份最高氣溫超過30℃的高溫日數(shù)多達22 d，平均最高氣溫29.0℃（21.8～38.5℃），持續(xù)時間較長，降雨量少，土壤呈半干旱狀況，土壤中J2數(shù)量顯著減少。2018年和2019年7月份最高氣溫超過30℃的高溫日有8 d，平均最高氣溫27.5℃（20.1～32.0℃），降雨量較2017年適中，土壤中J2數(shù)量明顯增加，這表明持續(xù)過高的溫度和過低的土壤含水量抑制大豆孢囊線蟲的侵染與生長發(fā)育。通過Spearman相關分析表明，線蟲的繁殖數(shù)量與平均溫度正相關，與降雨量無相關性，這與上述結果不一致，可能和最高氣溫持續(xù)期不同、降雨量分布不均勻有關，土壤中含水量過低或過高都會影響線蟲的生長，導致線蟲代數(shù)不完全和世代重疊現(xiàn)象出現(xiàn)，從而表現(xiàn)無相關性。降雨量和土壤含水量對大豆孢囊線蟲影響復雜，除了干旱和潮濕的影響，還應分析水分脅迫強度及時間等[28]，此部分內容有待更深層次研究。此外，每年9月中旬基本完成最后1代，根組織內各齡期幼蟲數(shù)量少，土壤中成熟孢囊數(shù)量少、個體小，這可能是大豆生長季后期植株衰老、根組織木栓化和供給營養(yǎng)少所致。

劉維志[6]指出，在中國，大豆孢囊線蟲1年可發(fā)生3～4代或6代。趙洪海等[13]和齊娜偉等[14]的研究表明，山東省大豆孢囊線蟲在2013年發(fā)生3代，2014年發(fā)生4代，各世代平均歷期30 d。美國明尼蘇達州南部大豆孢囊線蟲1年發(fā)生3～4代，從7月到11月，土壤中孢囊數(shù)量呈上升趨勢。本研究表明，2017年甘肅隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲發(fā)生3代，各代平均歷期較長，為35 d。2018年和2019年各代發(fā)育歷期較短，平均為28 d，發(fā)生4代。本文報道大豆孢囊線蟲世代平均歷期和世代數(shù)與上述報道略有差異，說明大豆孢囊線蟲世代歷期與當?shù)販囟?、品種抗性、土壤狀況和田間管理措施密切相關[12， 29]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤中J2侵入點是新生伸長組織，在側根和新生側根中各齡期線蟲數(shù)量多，主根中線蟲數(shù)量隨主根的生長而減少。在線蟲大量孵化時期，一條新生須根中線蟲侵染量最多達53條。

大豆孢囊線蟲屬于土傳線蟲病害，危害程度重，傳播途徑多，發(fā)病區(qū)域廣。孢囊抗逆性較強，能夠在干旱和低溫條件下長期存活，防治極其困難[20， 30]。本研究結果表明，大豆孢囊線蟲第1代發(fā)生量最大，是主要危害期，此時大豆根系脆弱、抵抗力差，容易被線蟲侵染，因此應以防治第1代發(fā)生為主，控制第2、3代侵染為輔。本課題組田間試驗表明，播種前，溝施0.5%阿維菌素顆粒劑和采用生物種衣劑菌線克SN101、SN102進行種子包衣處理均有一定防效[31]。大豆收獲后改種非寄主植物小麥、玉米、油菜和苜蓿等3～4年，每年可使土壤中孢囊基數(shù)減少20%左右[32]。

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（責任編輯：田 喆）