張根源 胡潤雨 陳向果 張漪 許豪 于士男 高艷 李巧云 唐建衛(wèi) 殷貴鴻

摘要 為優(yōu)化黃淮麥區(qū)小麥赤霉病抗性鑒定方法，于2020年在河南農業(yè)大學許昌校區(qū)試驗田對4個小麥品種進行單花滴注赤霉病抗性鑒定，分析不同套袋保濕天數(shù)對病情嚴重度的影響，并利用與主效抗病基因Fhb1連鎖的功能標記TaHRC-STS對其進行分子檢測。結果顯示：抗病品種‘蘇麥3號‘寧麥9號攜帶該基因，而感病品種不攜帶;套袋1～7 d處理均引起赤霉病菌侵染，病情嚴重度隨著套袋時間的延長而顯著增加，在套袋4～7 d處理下，同一抗、感品種的嚴重度間無顯著差異;且感病品種4～7 d的嚴重度顯著高于1～3 d處理（P<0.05），抗性評價也與1～3 d不同，這表明Fhb1基因能增強小麥赤霉病抗性。進行赤霉病抗性鑒定時，黃淮麥區(qū)以套袋保濕4 d的處理效果較好。

關鍵詞 小麥; 赤霉病; 保濕時間; 禾谷鐮刀菌; 抗性鑒定

中圖分類號： S435.121.45

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020704

Abstract In order to optimize the identification method of Fusarium head blight （FHB） resistance in Yellow and Huai River Valley wheat region of China， the FHB resistance of four wheat cultivars planted in experimental field of Xuchang campus of Henan Agricultural University were identified by single floret injection in 2020. The effects of different moisturizing days on the disease severity were analyzed， and then molecular analysis of the four wheat cultivars was performed using TaHRC-STS， a functional marker linked to Fhb1 gene of FHB resistance. The results indicated that resistant cultivars ‘Sumai 3 and ‘Ningmai 9 carried Fhb1 gene， while susceptible cultivars did not carry it， and the disease severity increased significantly with the extension of bagging time， and there was no significant difference between the same resistant and susceptible cultivars under bagging for four days to seven days. The severity of susceptible cultivars in 4-7 days was significantly higher than that in 1-3 days， and the evaluation of resistance was also different from that in 1-3 days， which indicated that Fhb1 gene could enhance the FHB resistance. In the identification of FHB resistance， bagging and moisturizing for four days was better in Yellow and Huai River Valley wheat region of China.

Key words wheat; Fusarium head blight; moisturizing time; Fusarium graminearum; resistance identification

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum Schw.引起的小麥真菌病害。近年來，受全球氣候變暖、輪作制度變化、秸稈還田措施等因素的影響，我國小麥赤霉病由長江中下游麥區(qū)開始向黃淮麥區(qū)迅速蔓延，發(fā)病面積日漸擴大[12]，已成為黃淮麥區(qū)小麥主要病害之一，嚴重威脅小麥生產。

培育和利用抗病品種是控制小麥赤霉病最簡便、最有效、最環(huán)保的途徑之一，而準確的抗性鑒定是選育抗病品種的基礎[3]。小麥赤霉病抗性分為抗侵入（TypeⅠ）、抗擴展（TypeⅡ）、籽?？垢腥荆═ypeⅢ）、耐病性（TypeⅣ）和抗毒素積累（TypeⅤ）等5類[46]，最容易準確鑒定的是抗擴展能力，一般采用單花滴注的方法進行[78]。

小麥抽穗至揚花初期是最易被赤霉病菌侵染的時期，該時期空氣濕度是影響小麥單花滴注后病菌侵染率的決定性因素[912]。通過對接種后的麥穗進行套袋保濕是保證空氣濕度的有效措施，目前大多數(shù)單位通常采用套袋保濕3 d處理[13]。而我們在多年的赤霉病抗性鑒定實踐中發(fā)現(xiàn)：黃淮麥區(qū)小麥抽穗至揚花期的天氣條件不同于南方麥區(qū)，套袋3 d處理有時候不能保證充分的發(fā)病，尤其是在天氣晴朗、多風、空氣濕度低的年份更加明顯，所以，套袋3 d不能完全適合黃淮麥區(qū)赤霉病抗性鑒定，但關于具體套袋天數(shù)的研究目前沒有報道?；诜肿訕擞浀姆N質資源評價能夠為新抗源的發(fā)現(xiàn)及利用提供一種有效途徑[14]，F(xiàn)hb1作為抗赤霉病主效基因被定位于小麥3B染色體短臂上，是目前抗性穩(wěn)定且效應最大的位點，該基因已經被成功克隆[1517]。gzslib202204041404

本研究利用Fhb1基因最新開發(fā)的功能性標記TaHRC-STS對小麥供試品種進行分子檢測，以明確是否含有Fhb1基因，以攜帶Fhb1的抗病品種與未攜帶該基因的感病品種為材料，分析不同套袋天數(shù)對小麥赤霉病抗性鑒定結果的影響，旨在明確黃淮麥區(qū)單花滴注最佳套袋時間，為赤霉病抗性的準確鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試小麥品種

供試小麥品種為‘蘇麥3號‘寧麥9號‘揚麥158和‘周麥18，其中‘蘇麥3號為高抗品種，‘寧麥9號為中抗品種，‘揚麥158為中感品種，‘周麥18為高感品種。4個品種均由河南農業(yè)大學小麥遺傳育種實驗室保存和提供。

1.2 田間試驗設計

試驗在黃淮麥區(qū)中部的河南農業(yè)大學許昌校區(qū)小麥試驗田進行，該地區(qū)地勢平整，排灌方便，土質為壤土，前茬為玉米，肥力水平較高，于2019年-2020年度將小麥供試品種進行秋播，采用人工開溝點播的方式，隨機排列，3次重復，每品種2行，行長3 m，株距10 cm，寬窄行40 cm×20 cm種植?！畬廂?號‘揚麥158與‘蘇麥3號開花初期為4月9日-10日，‘周麥18開花初期為4月18日。

1.3 致病菌的培養(yǎng)、田間接種與抗性評價

致病菌為禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum Schw.菌株14YY1-3、14KF3-8、14ZK1-4的混合菌株，由河南省農業(yè)科學院植物保護研究所提供，致病菌培養(yǎng)及孢子懸浮液制作參考徐飛等[9]的方法，懸浮液于接種前3 d 制備，接種前將各菌株等孢子量混合，用滅菌蒸餾水調至分生孢子濃度為5×105個/mL。

在小麥開花初期（10%麥穗中部開花），將20 μL配制好的孢子懸浮液（加入2～3 μL 96%的Tween-20），使用微量移液器注入麥穗中上部（從穗頂端往下第5排小穗）的1個小花內，并套袋保濕，共設置1、2、3、4、5、6、7 d等7個套袋時間處理。對接種麥穗進行剪芒標記，每個品種每個處理接種20穗。接種后21 d，調查發(fā)病小穗數(shù)、總小穗數(shù)及穗軸侵染情況，計算病小穗率（percentage of diseased spikelet， PDS）。

參照國家農業(yè)行業(yè)標準（NY/T 1443.4-2007）《小麥抗病蟲性評價技術規(guī)范》第四部分：“小麥抗赤霉病評價技術規(guī)范”進行抗性評價。首先依據(jù)病小穗率及穗軸侵染情況進行病情嚴重度等級劃分，分為0～4共5個等級，其中0級為接種小穗無可見發(fā)病癥狀;1級為小穗發(fā)病或相鄰個別小穗發(fā)病，病斑不擴展到穗軸;2級為穗軸發(fā)病，病小穗率<1/4;3級為穗軸發(fā)病，病小穗率1/4～1/2;4級為穗軸發(fā)病，病小穗率>1/2。計算供試小麥品種平均嚴重度并進行赤霉病抗性的5級抗性評價，分別為免疫（I，X=0）;抗（R，0

利用統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics 20.0對4個小麥品種不同套袋天數(shù)病小穗率與嚴重度進行差異顯著性分析（Duncans multiple range test）。

1.4 田間溫濕度測定

采用Cos-03溫濕度記錄儀（USB-TH）測定田間溫濕度變化，將其固定于田間并與小麥穗部同高，每隔10 min記錄一次溫濕度值，并根據(jù)溫濕度值對噴水時間進行相應調整，即每天10：00-14：00之間，當溫度高于25℃時用噴水帶進行噴水保濕，當濕度超過85%時停止噴水，當濕度低于70%時再次進行噴水，由于環(huán)境因素如天氣、風力等對空氣濕度的影響，每次噴水時間10～15 min不等，確保每天溫度在25℃左右時相對濕度維持在80%左右。連續(xù)記錄4個小麥品種從套袋第1 天到調查統(tǒng)計發(fā)病小穗數(shù)（21 d）。

1.5 抗病基因Fhb1的檢測

1.5.1 小麥基因組DNA提取

采用CTAB法[18]提取小麥基因組DNA，干燥后溶于TE緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 分子標記檢測

選用Su等[16]開發(fā)的功能性標記TaHRC-STS對Fhb1基因進行檢測（引物序列：F： 5′-ATTCCTACTAGCCGCCTGGT-3′，R： 5′-ACTGGGGCA-AGCAAACATTG-3′），以‘蘇麥3號為陽性對照，‘周麥18為陰性對照，所擴增出陽性片段和陰性片段大小分別為1 300 bp和2 000 bp。PCR體系和擴增程序：總反應體系為20 μL，其中2×Taq MasterMix（Dye）（北京康為世紀生物科技有限公司）10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA（50 ng/μL） 2 μL，超純水6 μL;在Applied Biosystems PCR儀（賽默飛世爾科技公司Thermo Fisher Scientific）上進行PCR，擴增程序為：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。引物合成由生工生物（上海）股份有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 不同保濕時間（套袋天數(shù)）對赤霉病抗性評價結果的影響

從表1中可看出，當套袋天數(shù)≤4 d時，赤霉病平均嚴重度隨著套袋天數(shù)的增加而增加;當套袋天數(shù)≥4 d時，平均嚴重度達到最大，套袋4～7 d處理的同一品種（包括抗病和感?。┑膰乐囟乳g無顯著差異。兩個抗病品種‘蘇麥3號與‘寧麥9號在套袋天數(shù)為3 d和4 d時平均嚴重度無顯著差異，而兩個感病品種套袋天數(shù)≥4 d時的嚴重度顯著高于套袋3 d處理，且抗性評價結果也不同，3 d套袋處理的‘揚麥158與‘周麥18的鑒定結果分別為中抗（MR）與中感（MS），而4～7 d處理的鑒定結果分別為中感（MS）與感（S）（圖1）。gzslib202204041405

2.2 田間溫濕度測定結果

從不同小麥品種接種赤霉菌（最早的4月9日、最晚的4月18日）到統(tǒng)計發(fā)病小穗數(shù)（最早的4月30日、最晚5月9日）共計30 d溫濕度變化如圖2所示。

田間濕度由于受到其他環(huán)境因素如氣溫、風力等影響較大而出現(xiàn)波動，相對濕度的變化范圍為37.8%～99.9%，但30 d平均濕度達到83.8%;空氣溫度變化范圍為1.8～36.6℃，30 d平均氣溫達到 17.4℃。通過噴水保濕并記錄相關溫、濕度，保證能夠為小麥赤霉病抗性鑒定創(chuàng)造良好且濕度相對穩(wěn)定的發(fā)病環(huán)境。

2.3 抗病基因Fhb1檢測結果

用抗赤霉病基因Fhb1功能性標記TaHRC-STS檢測4個小麥品種基因型，結果顯示（圖3），‘蘇麥3號‘寧麥9號擴增出1 300 bp的目的片段，而‘揚麥158和‘周麥18擴增片段大小為2 000 bp，表明‘蘇麥3號‘寧麥9號攜帶Fhb1抗赤霉病基因，而‘揚麥158和‘周麥18沒有攜帶Fhb1抗赤霉病基因。套袋4 d處理田間抗赤霉病單花滴注鑒定結果表明，‘蘇麥3號‘寧麥9號的抗性分別達到抗（R）、中抗（MR）水平，而‘揚麥158和‘周麥18的抗性水平分別為中感（MS）和感（S）。

3 討論

小麥赤霉病抗性鑒定結果受環(huán)境的影響，同一小麥品種在不同年度與地點間的鑒定結果可能不一致[19]。如‘揚麥158在長江中下游麥區(qū)多年鑒定結果為中抗[1，20]，但同時也有報道指出‘揚麥158中感赤霉病[2122]。本研究團隊在黃淮麥區(qū)經過多年抗性鑒定，其鑒定結果均為中感。因此，本研究中將‘揚麥158作為中感對照。

赤霉病抗擴展主要通過單花滴注的方法進行，通常采用套袋3 d處理[2326]。本研究結果表明，在黃淮麥區(qū)接種鑒定時不同套袋時間小麥赤霉病發(fā)病程度有較大的差異。不同抗性小麥品種在套袋1～7 d處理下均可以被赤霉病菌侵染，抗、感品種的平均嚴重度均隨著套袋時間的延長而顯著增加。當套袋天數(shù)≥4 d時小麥赤霉病均能夠充分發(fā)病，各品種平均嚴重度間無顯著差異;當套袋天數(shù)<4 d時，感病品種平均嚴重度與4～7 d相比差異顯著（P<0.05），抗性評價結果也不同。套袋時間過短會影響赤霉病菌繁殖和侵染，小麥發(fā)病不充分，抗性評價不準確，時間過長則會使袋內溫度過高影響赤霉病菌生長，且由于蒸騰作用導致袋內水分過多，小麥穗下節(jié)承重增加，遇到刮風天氣容易折斷[2728]。綜上所述，在黃淮麥區(qū)通過單花滴注進行赤霉病抗性鑒定，套袋4 d處理比較合適，既能確保小麥赤霉病充分發(fā)病，又能減少套袋對小麥正常生長發(fā)育的影響。

利用抗赤霉病主效抗病基因Fhb1分子標記輔助選擇技術已成為提高小麥品種赤霉病抗性的有效手段。張宏軍等[29]以‘生選6號為供體構建的回交群體與輪回親本‘周麥16號相比，平均病小穗數(shù)和平均病情指數(shù)均顯著降低。Bemardo等[30]利用分子標記將‘寧7840所攜帶的Fhb1導入到美國硬粒冬性小麥中，赤霉病抗性得到顯著提高。我國長江中下游麥區(qū)同樣利用Fhb1基因育成了‘寧麥9號‘寧麥13等赤霉病抗性良好的小麥品種[31]，而黃淮麥區(qū)作為我國小麥主產區(qū)，目前還沒有大面積推廣中抗品種或高抗品種。因此，導入Fhb1基因是提高黃淮麥區(qū)小麥品種赤霉病抗性的首要目標。本研究中，小麥品種‘蘇麥3號‘寧麥9號經分子標記檢測均攜帶Fhb1，赤霉病抗性均達到中抗及以上水平且平均嚴重度受套袋天數(shù)影響相對較小，驗證了Fhb1賦予小麥較強的抗擴展能力，它也被公認為是目前發(fā)現(xiàn)效應最大、抗性最穩(wěn)定的抗赤霉病基因[3234]。

穩(wěn)定且準確的田間赤霉病抗性鑒定是小麥抗赤霉病育種工作的保障，而能夠對不同小麥品種作出準確抗性評價的前提則是確保接種的赤霉病菌充分侵染發(fā)病。本研究選擇代表性的抗、感品種，并結合抗赤霉病主效基因Fhb1分子標記檢測，通過設置不同套袋天數(shù)處理得出了黃淮麥區(qū)單花滴注最佳保濕時間（套袋4 d），有助于優(yōu)化小麥赤霉病抗性鑒定方法，得到準確的赤霉病抗病性鑒定結果，為黃淮麥區(qū)小麥抗赤霉病遺傳育種提供了技術參考。

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