段家琪 武卓宇 翟慧嫻 張育平 于榮榮

摘要 為了篩選在不同發(fā)育天數(shù)的飛蝗5齡若蟲前腸中及其前腸不同部位能夠穩(wěn)定表達的最適內參基因，選用β-肌動蛋白（β-actin）、延伸因子1-α（EF-1α）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、核糖體蛋白49（RP49）和α-微管蛋白（α-tubulin）5個基因作為候選內參基因，利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）分析各候選內參基因的相對表達量，采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件相結合，篩選出5齡飛蝗前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中的最適內參基因。結果表明，β-actin和α-tubulin為前腸不同部位最適內參基因組合，β-actin、α-tubulin和GAPDH為不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中最適內參基因組合。本文為飛蝗腸道關鍵靶基因分子特性及進一步生物學功能研究提供重要理論基礎。

關鍵詞 飛蝗; 前腸; qRT-PCR; 最適內參基因

中圖分類號： S433.2

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021175

Abstract In order to screen the optimal internal reference genes that can be stably expressed in different segments of foregut and foregut of 5th-instar Locusta migratoria on different developmental days， five candidate genes， including β-actin， EF-1α， GAPDH， RP49 and α-tubulin， were selected as internal reference genes. Real time quantitative PCR （qRT-PCR） was performed to analyze the relative expression of each candidate gene. The optimal internal reference genes were screened out by using geNorm， NormFinder and Bestkeeper software. The results showed that β-actin and α-tubulin was the most suitable gene combination for different parts of foregut， and β-actin， α-tubulin and GAPDH were the most suitable internal reference genes for foregut of 5th-instar nymphs of L.migratoria on different developmental days. This study provides an important theoretical basis for further study of the molecular characteristics and biological functions of the key target genes in L.migratoria.

Key words Locusta migratoria; foregut; qRT-PCR; optimal internal reference genes

飛蝗Locusta migratoria是典型的農業(yè)害蟲，同時也是昆蟲學研究的經(jīng)典模式昆蟲，由于其具有食量大、易遷飛等特點，一旦發(fā)生蝗災，會嚴重影響農業(yè)生產[1]。飛蝗前腸位于腸道最前端，具有儲存、過濾和研磨食物的功能[2]。其前腸主要由食道（esophagus，Es）、嗉囊（crop，Cr）和前胃（proventriculus，Pr）組成[3]。食道是首先接觸食物的部位，其中有齒，可以防止食物倒流;嗉囊具有暫時儲存食物和對食物進行初步消化的功能;前胃除了儲存和研磨食物外，可將食物下推至后面部位[4]。

隨著分子生物學技術快速發(fā)展以及全基因組信息發(fā)布，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術已廣泛應用于基因分子特性研究[5]。qRT-PCR常用于檢測目的基因轉錄水平的表達，具有準確性高、重復性好、靈敏度強等特點，但其結果易受變量影響，如RNA的數(shù)量、純度等[6]。qRT-PCR為相對定量的常用方法，其優(yōu)點為不需明確標準品用量[7]。最適內參基因即在不同試驗條件和不同類型的組織和細胞中，均恒定表達且表達量無明顯差異的基因[8]。為了保證試驗結果的準確性，分析前需要選擇最適的內參基因對目的基因進行數(shù)據(jù)校正，此步驟是保證qRT-PCR檢測結果準確和可靠的關鍵因素，對試驗結果的校準具有重要意義[910]。

昆蟲不同齡期和不同組織部位最適內參基因組合具有特異性。如瓜實蠅Bactrocera cucurbitae不同蟲態(tài)在不同溫度脅迫下內參基因組合為核糖體蛋白S13（RPS13）和核糖體蛋白L32（RPL32）[11]。大灰象甲Sympiezomias velatus成蟲不同組織內參基因組合為α-微管蛋白基因（TUA），β-微管蛋白基因（TUB），核糖體蛋白S20（RPS20）和核糖體蛋白L12（RPL12）[12]。美國白蛾Hyphantria cunea不同發(fā)育階段內參基因組合為RPL12和延伸因子1-β（EF-1β）;幼蟲不同部位內參基因組合為肌動蛋白（ACT）和核糖體蛋白S16（RPS16）[13]。牧草盲蝽Lygus pratensis不同齡期內參基因組合為轉錄起始因子TFIID亞基基因（TAF），谷胱甘肽S-轉移酶基因（GST）和泛素蛋白基因（UBQ），不同部位內參基因組合RPL32和TAF[14]。飛蝗5齡整蟲不同組織部位最適內參基因為EF-1α和GADPH，不同發(fā)育天數(shù)若蟲的最適內參基因組合為β-actin和RP49[7，15]。昆蟲特定組織部位最適內參基因組合是否與整蟲最適內參相一致，目前未有報道。本文以5齡飛蝗前腸為研究對象，選取5個常用的內參基因，采用qRT-PCR檢測各基因在飛蝗前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中的相對表達量，進一步使用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件綜合分析5個候選內參基因的表達穩(wěn)定性，綜合其結果篩選獲得最適內參基因并明確內參基因個數(shù)，為研究飛蝗前腸靶基因的表達情況和生物學功能提供了重要理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

飛蝗蟲卵取自河北滄州飛蝗養(yǎng)殖基地，將購買的蟲卵放置在敞口培養(yǎng)盤中，用保鮮膜封好口，并在上面扎孔以保證空氣流通，將其放置在人工培養(yǎng)箱中，溫度（30±2）℃，相對濕度（40±10）%，光照周期L∥D=14 h∥10 h。待蟲卵孵化后，將孵化出的蝗蝻轉移至邊長為25 cm的正方體紗籠中，每天飼喂新鮮的小麥幼苗，待其長至3齡若蟲時加喂麥麩，至5齡若蟲時進行試驗。

1.2 主要儀器和試劑

D3024臺式高速微量離心機（SCILOGEX，美國），D3024R臺式高速微量冷凍型離心機（SCILOGEX，美國），NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國），DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠），Bio-Rad 凝膠成像儀（Bio-Rad，美國），StepOne/StepOnePlus實時熒光定量PCR儀（ABI，美國）。

RNAisoTMPlus、Hiscript Ⅲ RT SuperMix for qPCR購自天根生化科技有限公司（北京）;2×Taq PCR MasterMix購自全式金生物技術有限公司（北京）;SYBR GREEN實時定量試劑盒購自TaKaRa公司（日本），異丙醇等均為國產分析純。

1.3 飛蝗前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲樣品總RNA提取

1.3.1 前腸不同部位取樣

選取5齡2 日齡若蟲，在冰上將其前腸不同部位（食道、嗉囊、前胃）小心分離，并分別放于不同1.5 mL EP管中，液氮速凍，-80℃保存。設置4個生物學重復，每個重復8頭蟲。

1.3.2 不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸的取樣

從5齡第1天（N5D1）開始，每隔24 h取8頭蟲，在冰上進行解剖，取其前腸，連續(xù)取樣8 d。將解剖好的新鮮組織放于1.5 mL EP管中，液氮速凍，-80℃保存。設置4個生物學重復，每個重復8頭蟲。

1.3.3 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

將盛有前腸組織的EP管置于冰上，加入RNAiso Plus，在盛有液氮的勻漿器中研磨。冰上靜置5 min，加入200 μL氯仿，振蕩2 min。樣品在冰上放置15 min后，4℃ 12 000 g離心5 min。取上清液加入等體積的異丙醇，混勻，冰上靜置15 min。12 000 g離心10 min，棄掉上清液后向沉淀中加入1 mL預冷的75%乙醇。4℃ 12 000 g離心5 min，沉淀晾干后加入適量的DEPC水至完全溶解。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA的完整性，用NanoDrop2000 測定總RNA的濃度。

以1 μg總RNA為模板，用 M-MLV 反轉錄酶將其反轉錄成第一鏈cDNA，隨后將其置于-80℃冰箱備用。

1.4 候選內參基因篩選和引物設計

搜索飛蝗轉錄組數(shù)據(jù)庫，選取5個不同功能的基因，分別為β-actin、EF-1α、GAPDH、RP49和α-tubulin作為候選內參基因[16]。使用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行引物特異性比對。引物合成由上海英濰捷基公司合成。引物信息見表1。

1.5 候選內參基因的qRT-PCR檢測

以cDNA作為模板，參照試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應。反應體系：SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ 10 μL，cDNA模板 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各 0.8 μL，ddH2O 6.4 μL;程序：95℃預變性10 s;95℃變性5 s，60℃退火并延伸30 s，共40個循環(huán)。擴增結束后，在60℃時進行熒光檢測。溫度以1℃/min的速率從60℃上升到95℃。連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲得熔解曲線，從而對DNA進行熔解分析。每個樣品設置4個生物學重復和2個技術重復，分別對上述5對引物進行qRT-PCR反應，反應結束后收集數(shù)據(jù)進行分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

通過2-ΔCt方法計算出各候選內參基因的相對表達量，利用geNorm軟件分析得到候選內參基因的表達穩(wěn)定值（M），M值越小內參基因的穩(wěn)定性越好。進一步利用geNorm計算配對變異值（pairwise variations，V），確定最適內參基因個數(shù)[1718]。以標準化因子的配對變異值（0.15）作為閾值，將Vn/Vn+1對應的配對變異值與0.15做比較，>0.15時需要n+1個內參基因，<0.15時則需要n個內參基因。再使用NormFinder和BestKeeper軟件對候選內參基因進行分析，綜合3種軟件的分析結果篩選出表達最穩(wěn)定的內參基因。

2 結果與分析

2.1 geNorm軟件分析

2.1.1 最適內參基因篩選

采用geNorm程序分析5個候選內參基因在前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中的表達穩(wěn)定性（圖1a，1b），5個候選內參基因在前腸不同部位中表達穩(wěn)定值（M）順序為：GAPDH（0.766 9）>RP49（0.448 7）>EF-1α（0.373 2）>α-tubulin=β-actin（0.291 3），5個基因的M值均<1.5，表達均較為穩(wěn)定，其中，α-tubulin和β-actin的M值最小，表達最穩(wěn)定;在不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中M值順序為： EF-1α（0.678 2）>RP49（0.623 6）>β-actin（0.602 5）>α-tubulin=GAPDH （0.536 7），5個基因的M值均<1.5，表達均較為穩(wěn)定，其中，α-tubulin和GAPDH的M值最小，表達最穩(wěn)定。

2.1.2 最適內參基因個數(shù)確定

利用geNorm軟件對5個內參基因在前腸不同部位以及不同發(fā)育天數(shù)若蟲的前腸中的M值進行分析，得到兩個歸一化最適內參基因數(shù)目柱形圖（圖2），由圖2a可知，V2/V3對應配對變異值為0.131 1<0.15，試驗中應選擇2個基因作為最適內參基因組合。因此，選擇表達穩(wěn)定性較好的2個基因（β-actin和α-tubulin）為前腸不同部位的最適內參基因組合。由圖2b可知，V2/V3對應配對變異值為 0.192 4>0.15，V3/V4 對應的值為 0.136 8<0.15，說明加入第3個內參基因后提高了內參基因組合的穩(wěn)定性，因此對于不同發(fā)育時期的前腸應選擇3個基因作為最適內參基因組合。推薦表達穩(wěn)定性較好的3個基因（β-actin、α-tubulin和GAPDH）為不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸的最適內參基因組合。

2.2 NormFinder程序分析

使用NormFinder軟件分析后獲得5個候選內參基因分別在前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸的表達穩(wěn)定值 （M），根據(jù)M值越小，基因表達越穩(wěn)定原則，NormFinder軟件篩選獲得表達最穩(wěn)定的內參基因。由表2可知，在前腸不同部位中β-actin基因表達最穩(wěn)定;在不同發(fā)育天數(shù)若蟲的前腸中GAPDH基因表達最穩(wěn)定。

2.3 Bestkeeper程序分析

將qRT-PCR得到的不同內參基因的Ct值輸入到BestKeeper軟件中內置Excel表格中計算出標準偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）。SD和CV值越小基因表達越穩(wěn)定。當SD>1.5，說明基因表達不穩(wěn)定，不適合作為內參基因。由表3可知，在前腸不同部位中基因α-tubulin的SD值最小且CV值也最小，因此，表達最為穩(wěn)定;由表4可知，在不同發(fā)育天數(shù)若蟲的前腸中基因β-actin的SD值最小且CV值相對較小，因此，表達最為穩(wěn)定。

3 討論

本試驗采用3個軟件篩選獲得β-actin在不同發(fā)育天數(shù)的5齡飛蝗前腸及前腸的不同部位均穩(wěn)定表達，為最適內參基因。這一結果與不同發(fā)育天數(shù)的5齡飛蝗中β-actin表達穩(wěn)定相一致[7]，說明β-actin在飛蝗整蟲和特定部位前腸中具有保守性。同一內參基因在不同處理中具有保守性這一特點同樣存在于其他昆蟲中。如沙漠蝗Schistocerca gregaria成蟲腦部中EF-1a表達穩(wěn)定，澳大利亞疫蝗Chortoicetes terminifera神經(jīng)組織中EF-1a表達穩(wěn)定，因此，EF-1a可以作為神經(jīng)組織中的最適內參基因[1920]。

本研究表明，不同發(fā)育天數(shù)的5齡飛蝗前腸的最適內參基因組合為β-actin、α-tubulin和GAPDH;而文獻報道，不同發(fā)育天數(shù)5齡若蟲整蟲的最適內參基因組合為β-actin和RP49;3齡若蟲在微孢子感染脅迫下內參基因組合為ACT，EF1和TUB[7，21]。導致結果不一致的原因可能是在同一昆蟲的不同發(fā)育階段或不同部位表達穩(wěn)定的內參基因組合可能是不同的，即具有部位和時間特異性。該現(xiàn)象也存在于其他昆蟲中，如美國白蛾幼蟲不同組織中最適內參基因為ACT;不同發(fā)育時期最適內參基因組合為RPL12和EF-1β[13]。綜上所述，選取特定組織部位和齡期進行試驗時，對靶標基因表達譜進行系統(tǒng)內部穩(wěn)定性評價尤為重要。

本文選用geNorm、Normfinder和Bestkeeper 3個軟件對候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行綜合性分析評估，篩選出最適內參基因和內參基因個數(shù)。目前，采用該種方法進行最適內參基因的篩選試驗已在植物和動物中得到廣泛的應用[22]。如珙桐Davidia involucrata不同營養(yǎng)器官最適內參基因篩選[23]，鐵皮石斛Dendrobium officinale不同組織和不同生長階段最適內參基因篩選[24]，小鼠Mus musculus脂肪組織冷暴露和CL316243刺激下最適內參基因篩選[25]，小鼠睪丸最適內參基因篩選[26]。本文以飛蝗5齡若蟲為研究對象，選取不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲的前腸，利用qRT-PCR技術檢測了來自于飛蝗轉錄組數(shù)據(jù)庫中5個候選內參基因β-actin、EF-1α、GAPDH、RP-49和α-tubulin的表達水平，并對各候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行綜合性分析后，篩選獲得2個最適合前腸不同部位基因研究的內參基因，分別為β-actin和α-tubulin。同時獲得3個可作為5齡飛蝗發(fā)育過程中前腸基因研究的最適內參基因，分別為β-actin、α-tubulin和GAPDH。研究結果篩選獲得飛蝗前腸最適內參基因，將為前腸靶標基因的分子特性研究和生物學功能研究提供重要理論基礎，同時對其他昆蟲內參基因的篩選具有一定的參考價值。

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（責任編輯：田 喆）