段家琪 武卓宇 翟慧嫻 張育平 于榮榮

摘要 為了篩選在不同發(fā)育天數(shù)的飛蝗5齡若蟲前腸中及其前腸不同部位能夠穩(wěn)定表達(dá)的最適內(nèi)參基因，選用β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、延伸因子1-α（EF-1α）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、核糖體蛋白49（RP49）和α-微管蛋白（α-tubulin）5個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）分析各候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件相結(jié)合，篩選出5齡飛蝗前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中的最適內(nèi)參基因。結(jié)果表明，β-actin和α-tubulin為前腸不同部位最適內(nèi)參基因組合，β-actin、α-tubulin和GAPDH為不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中最適內(nèi)參基因組合。本文為飛蝗腸道關(guān)鍵靶基因分子特性及進(jìn)一步生物學(xué)功能研究提供重要理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 飛蝗; 前腸; qRT-PCR; 最適內(nèi)參基因

中圖分類號(hào)： S433.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021175

Abstract In order to screen the optimal internal reference genes that can be stably expressed in different segments of foregut and foregut of 5th-instar Locusta migratoria on different developmental days， five candidate genes， including β-actin， EF-1α， GAPDH， RP49 and α-tubulin， were selected as internal reference genes. Real time quantitative PCR （qRT-PCR） was performed to analyze the relative expression of each candidate gene. The optimal internal reference genes were screened out by using geNorm， NormFinder and Bestkeeper software. The results showed that β-actin and α-tubulin was the most suitable gene combination for different parts of foregut， and β-actin， α-tubulin and GAPDH were the most suitable internal reference genes for foregut of 5th-instar nymphs of L.migratoria on different developmental days. This study provides an important theoretical basis for further study of the molecular characteristics and biological functions of the key target genes in L.migratoria.

Key words Locusta migratoria; foregut; qRT-PCR; optimal internal reference genes

飛蝗Locusta migratoria是典型的農(nóng)業(yè)害蟲，同時(shí)也是昆蟲學(xué)研究的經(jīng)典模式昆蟲，由于其具有食量大、易遷飛等特點(diǎn)，一旦發(fā)生蝗災(zāi)，會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]。飛蝗前腸位于腸道最前端，具有儲(chǔ)存、過濾和研磨食物的功能[2]。其前腸主要由食道（esophagus，Es）、嗉囊（crop，Cr）和前胃（proventriculus，Pr）組成[3]。食道是首先接觸食物的部位，其中有齒，可以防止食物倒流;嗉囊具有暫時(shí)儲(chǔ)存食物和對(duì)食物進(jìn)行初步消化的功能;前胃除了儲(chǔ)存和研磨食物外，可將食物下推至后面部位[4]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展以及全基因組信息發(fā)布，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因分子特性研究[5]。qRT-PCR常用于檢測目的基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、靈敏度強(qiáng)等特點(diǎn)，但其結(jié)果易受變量影響，如RNA的數(shù)量、純度等[6]。qRT-PCR為相對(duì)定量的常用方法，其優(yōu)點(diǎn)為不需明確標(biāo)準(zhǔn)品用量[7]。最適內(nèi)參基因即在不同試驗(yàn)條件和不同類型的組織和細(xì)胞中，均恒定表達(dá)且表達(dá)量無明顯差異的基因[8]。為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，分析前需要選擇最適的內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行數(shù)據(jù)校正，此步驟是保證qRT-PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確和可靠的關(guān)鍵因素，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的校準(zhǔn)具有重要意義[910]。

昆蟲不同齡期和不同組織部位最適內(nèi)參基因組合具有特異性。如瓜實(shí)蠅Bactrocera cucurbitae不同蟲態(tài)在不同溫度脅迫下內(nèi)參基因組合為核糖體蛋白S13（RPS13）和核糖體蛋白L32（RPL32）[11]。大灰象甲Sympiezomias velatus成蟲不同組織內(nèi)參基因組合為α-微管蛋白基因（TUA），β-微管蛋白基因（TUB），核糖體蛋白S20（RPS20）和核糖體蛋白L12（RPL12）[12]。美國白蛾Hyphantria cunea不同發(fā)育階段內(nèi)參基因組合為RPL12和延伸因子1-β（EF-1β）;幼蟲不同部位內(nèi)參基因組合為肌動(dòng)蛋白（ACT）和核糖體蛋白S16（RPS16）[13]。牧草盲蝽Lygus pratensis不同齡期內(nèi)參基因組合為轉(zhuǎn)錄起始因子TFIID亞基基因（TAF），谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因（GST）和泛素蛋白基因（UBQ），不同部位內(nèi)參基因組合RPL32和TAF[14]。飛蝗5齡整蟲不同組織部位最適內(nèi)參基因?yàn)镋F-1α和GADPH，不同發(fā)育天數(shù)若蟲的最適內(nèi)參基因組合為β-actin和RP49[7，15]。昆蟲特定組織部位最適內(nèi)參基因組合是否與整蟲最適內(nèi)參相一致，目前未有報(bào)道。本文以5齡飛蝗前腸為研究對(duì)象，選取5個(gè)常用的內(nèi)參基因，采用qRT-PCR檢測各基因在飛蝗前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)一步使用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件綜合分析5個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，綜合其結(jié)果篩選獲得最適內(nèi)參基因并明確內(nèi)參基因個(gè)數(shù)，為研究飛蝗前腸靶基因的表達(dá)情況和生物學(xué)功能提供了重要理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

飛蝗蟲卵取自河北滄州飛蝗養(yǎng)殖基地，將購買的蟲卵放置在敞口培養(yǎng)盤中，用保鮮膜封好口，并在上面扎孔以保證空氣流通，將其放置在人工培養(yǎng)箱中，溫度（30±2）℃，相對(duì)濕度（40±10）%，光照周期L∥D=14 h∥10 h。待蟲卵孵化后，將孵化出的蝗蝻轉(zhuǎn)移至邊長為25 cm的正方體紗籠中，每天飼喂新鮮的小麥幼苗，待其長至3齡若蟲時(shí)加喂麥麩，至5齡若蟲時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 主要儀器和試劑

D3024臺(tái)式高速微量離心機(jī)（SCILOGEX，美國），D3024R臺(tái)式高速微量冷凍型離心機(jī)（SCILOGEX，美國），NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國），DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠），Bio-Rad 凝膠成像儀（Bio-Rad，美國），StepOne/StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，美國）。

RNAisoTMPlus、Hiscript Ⅲ RT SuperMix for qPCR購自天根生化科技有限公司（北京）;2×Taq PCR MasterMix購自全式金生物技術(shù)有限公司（北京）;SYBR GREEN實(shí)時(shí)定量試劑盒購自TaKaRa公司（日本），異丙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.3 飛蝗前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲樣品總RNA提取

1.3.1 前腸不同部位取樣

選取5齡2 日齡若蟲，在冰上將其前腸不同部位（食道、嗉囊、前胃）小心分離，并分別放于不同1.5 mL EP管中，液氮速凍，-80℃保存。設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭蟲。

1.3.2 不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸的取樣

從5齡第1天（N5D1）開始，每隔24 h取8頭蟲，在冰上進(jìn)行解剖，取其前腸，連續(xù)取樣8 d。將解剖好的新鮮組織放于1.5 mL EP管中，液氮速凍，-80℃保存。設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭蟲。

1.3.3 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

將盛有前腸組織的EP管置于冰上，加入RNAiso Plus，在盛有液氮的勻漿器中研磨。冰上靜置5 min，加入200 μL氯仿，振蕩2 min。樣品在冰上放置15 min后，4℃ 12 000 g離心5 min。取上清液加入等體積的異丙醇，混勻，冰上靜置15 min。12 000 g離心10 min，棄掉上清液后向沉淀中加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇。4℃ 12 000 g離心5 min，沉淀晾干后加入適量的DEPC水至完全溶解。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA的完整性，用NanoDrop2000 測定總RNA的濃度。

以1 μg總RNA為模板，用 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，隨后將其置于-80℃冰箱備用。

1.4 候選內(nèi)參基因篩選和引物設(shè)計(jì)

搜索飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，選取5個(gè)不同功能的基因，分別為β-actin、EF-1α、GAPDH、RP49和α-tubulin作為候選內(nèi)參基因[16]。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行引物特異性比對(duì)。引物合成由上海英濰捷基公司合成。引物信息見表1。

1.5 候選內(nèi)參基因的qRT-PCR檢測

以cDNA作為模板，參照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ 10 μL，cDNA模板 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各 0.8 μL，ddH2O 6.4 μL;程序：95℃預(yù)變性10 s;95℃變性5 s，60℃退火并延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，在60℃時(shí)進(jìn)行熒光檢測。溫度以1℃/min的速率從60℃上升到95℃。連續(xù)測定樣品的熒光強(qiáng)度以獲得熔解曲線，從而對(duì)DNA進(jìn)行熔解分析。每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)和2個(gè)技術(shù)重復(fù)，分別對(duì)上述5對(duì)引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

通過2-ΔCt方法計(jì)算出各候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，利用geNorm軟件分析得到候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值（M），M值越小內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。進(jìn)一步利用geNorm計(jì)算配對(duì)變異值（pairwise variations，V），確定最適內(nèi)參基因個(gè)數(shù)[1718]。以標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異值（0.15）作為閾值，將Vn/Vn+1對(duì)應(yīng)的配對(duì)變異值與0.15做比較，>0.15時(shí)需要n+1個(gè)內(nèi)參基因，<0.15時(shí)則需要n個(gè)內(nèi)參基因。再使用NormFinder和BestKeeper軟件對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行分析，綜合3種軟件的分析結(jié)果篩選出表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 geNorm軟件分析

2.1.1 最適內(nèi)參基因篩選

采用geNorm程序分析5個(gè)候選內(nèi)參基因在前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中的表達(dá)穩(wěn)定性（圖1a，1b），5個(gè)候選內(nèi)參基因在前腸不同部位中表達(dá)穩(wěn)定值（M）順序?yàn)椋篏APDH（0.766 9）>RP49（0.448 7）>EF-1α（0.373 2）>α-tubulin=β-actin（0.291 3），5個(gè)基因的M值均<1.5，表達(dá)均較為穩(wěn)定，其中，α-tubulin和β-actin的M值最小，表達(dá)最穩(wěn)定;在不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸中M值順序?yàn)椋?EF-1α（0.678 2）>RP49（0.623 6）>β-actin（0.602 5）>α-tubulin=GAPDH （0.536 7），5個(gè)基因的M值均<1.5，表達(dá)均較為穩(wěn)定，其中，α-tubulin和GAPDH的M值最小，表達(dá)最穩(wěn)定。

2.1.2 最適內(nèi)參基因個(gè)數(shù)確定

利用geNorm軟件對(duì)5個(gè)內(nèi)參基因在前腸不同部位以及不同發(fā)育天數(shù)若蟲的前腸中的M值進(jìn)行分析，得到兩個(gè)歸一化最適內(nèi)參基因數(shù)目柱形圖（圖2），由圖2a可知，V2/V3對(duì)應(yīng)配對(duì)變異值為0.131 1<0.15，試驗(yàn)中應(yīng)選擇2個(gè)基因作為最適內(nèi)參基因組合。因此，選擇表達(dá)穩(wěn)定性較好的2個(gè)基因（β-actin和α-tubulin）為前腸不同部位的最適內(nèi)參基因組合。由圖2b可知，V2/V3對(duì)應(yīng)配對(duì)變異值為 0.192 4>0.15，V3/V4 對(duì)應(yīng)的值為 0.136 8<0.15，說明加入第3個(gè)內(nèi)參基因后提高了內(nèi)參基因組合的穩(wěn)定性，因此對(duì)于不同發(fā)育時(shí)期的前腸應(yīng)選擇3個(gè)基因作為最適內(nèi)參基因組合。推薦表達(dá)穩(wěn)定性較好的3個(gè)基因（β-actin、α-tubulin和GAPDH）為不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸的最適內(nèi)參基因組合。

2.2 NormFinder程序分析

使用NormFinder軟件分析后獲得5個(gè)候選內(nèi)參基因分別在前腸不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲前腸的表達(dá)穩(wěn)定值 （M），根據(jù)M值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定原則，NormFinder軟件篩選獲得表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。由表2可知，在前腸不同部位中β-actin基因表達(dá)最穩(wěn)定;在不同發(fā)育天數(shù)若蟲的前腸中GAPDH基因表達(dá)最穩(wěn)定。

2.3 Bestkeeper程序分析

將qRT-PCR得到的不同內(nèi)參基因的Ct值輸入到BestKeeper軟件中內(nèi)置Excel表格中計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）。SD和CV值越小基因表達(dá)越穩(wěn)定。當(dāng)SD>1.5，說明基因表達(dá)不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參基因。由表3可知，在前腸不同部位中基因α-tubulin的SD值最小且CV值也最小，因此，表達(dá)最為穩(wěn)定;由表4可知，在不同發(fā)育天數(shù)若蟲的前腸中基因β-actin的SD值最小且CV值相對(duì)較小，因此，表達(dá)最為穩(wěn)定。

3 討論

本試驗(yàn)采用3個(gè)軟件篩選獲得β-actin在不同發(fā)育天數(shù)的5齡飛蝗前腸及前腸的不同部位均穩(wěn)定表達(dá)，為最適內(nèi)參基因。這一結(jié)果與不同發(fā)育天數(shù)的5齡飛蝗中β-actin表達(dá)穩(wěn)定相一致[7]，說明β-actin在飛蝗整蟲和特定部位前腸中具有保守性。同一內(nèi)參基因在不同處理中具有保守性這一特點(diǎn)同樣存在于其他昆蟲中。如沙漠蝗Schistocerca gregaria成蟲腦部中EF-1a表達(dá)穩(wěn)定，澳大利亞疫蝗Chortoicetes terminifera神經(jīng)組織中EF-1a表達(dá)穩(wěn)定，因此，EF-1a可以作為神經(jīng)組織中的最適內(nèi)參基因[1920]。

本研究表明，不同發(fā)育天數(shù)的5齡飛蝗前腸的最適內(nèi)參基因組合為β-actin、α-tubulin和GAPDH;而文獻(xiàn)報(bào)道，不同發(fā)育天數(shù)5齡若蟲整蟲的最適內(nèi)參基因組合為β-actin和RP49;3齡若蟲在微孢子感染脅迫下內(nèi)參基因組合為ACT，EF1和TUB[7，21]。導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因可能是在同一昆蟲的不同發(fā)育階段或不同部位表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合可能是不同的，即具有部位和時(shí)間特異性。該現(xiàn)象也存在于其他昆蟲中，如美國白蛾幼蟲不同組織中最適內(nèi)參基因?yàn)锳CT;不同發(fā)育時(shí)期最適內(nèi)參基因組合為RPL12和EF-1β[13]。綜上所述，選取特定組織部位和齡期進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，對(duì)靶標(biāo)基因表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)內(nèi)部穩(wěn)定性評(píng)價(jià)尤為重要。

本文選用geNorm、Normfinder和Bestkeeper 3個(gè)軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行綜合性分析評(píng)估，篩選出最適內(nèi)參基因和內(nèi)參基因個(gè)數(shù)。目前，采用該種方法進(jìn)行最適內(nèi)參基因的篩選試驗(yàn)已在植物和動(dòng)物中得到廣泛的應(yīng)用[22]。如珙桐Davidia involucrata不同營養(yǎng)器官最適內(nèi)參基因篩選[23]，鐵皮石斛Dendrobium officinale不同組織和不同生長階段最適內(nèi)參基因篩選[24]，小鼠Mus musculus脂肪組織冷暴露和CL316243刺激下最適內(nèi)參基因篩選[25]，小鼠睪丸最適內(nèi)參基因篩選[26]。本文以飛蝗5齡若蟲為研究對(duì)象，選取不同部位和不同發(fā)育天數(shù)若蟲的前腸，利用qRT-PCR技術(shù)檢測了來自于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中5個(gè)候選內(nèi)參基因β-actin、EF-1α、GAPDH、RP-49和α-tubulin的表達(dá)水平，并對(duì)各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行綜合性分析后，篩選獲得2個(gè)最適合前腸不同部位基因研究的內(nèi)參基因，分別為β-actin和α-tubulin。同時(shí)獲得3個(gè)可作為5齡飛蝗發(fā)育過程中前腸基因研究的最適內(nèi)參基因，分別為β-actin、α-tubulin和GAPDH。研究結(jié)果篩選獲得飛蝗前腸最適內(nèi)參基因，將為前腸靶標(biāo)基因的分子特性研究和生物學(xué)功能研究提供重要理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)其他昆蟲內(nèi)參基因的篩選具有一定的參考價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：田 喆）