徐小偉 陳雯 丁詩文 甘海鋒 張坤 賀振

摘要 甘蔗線條花葉病毒Sugarcane streak mosaic virus（SCSMV）是引起甘蔗花葉病的主要病原之一，在世界各大蔗區(qū)普遍發(fā)生，嚴重威脅甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。建立快速有效的檢測方法對于SCSMV的防控有著重要意義。本研究依據(jù)SCSMV P1基因序列合成一對引物，擴增獲得1 074 bp的目的基因，將目的基因與原核表達載體pET28a連接，獲得pET28a-P1SCSMV。將連接正確的重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta菌株，經(jīng)IPTG誘導后，SDS-PAGE電泳檢測顯示在分子量約為42 kDa處有目的蛋白帶，與預期的SCSMV P1大小一致。融合蛋白主要是以可溶性蛋白的形式存在。利用鎳柱親和純化重組的SCSMV P1蛋白，并免疫健康新西蘭大白兔，制備兔抗血清。Western blot分析顯示，在對多個樣品進行檢測時制備的抗血清能特異性地識別SCSMV的P1蛋白，在受SCSMV侵染的甘蔗植株中能檢測到P1蛋白的表達，而在健康植株中檢測不到P1蛋白的表達。制備的抗血清稀釋至1∶20 000時仍能特異地檢測到目的蛋白條帶，說明通過大腸桿菌表達P1制備的SCSMV抗血清特異性強，效價高。本研究為SCSMV的快速檢測提供了有效方法。

關鍵詞 甘蔗線條花葉病毒; P1蛋白; 原核表達; 抗血清

中圖分類號： S435.661

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021042

Abstract Sugarcane streak mosaic virus （SCSMV） is one of the main pathogens that cause sugarcane mosaic disease. It occurs in major sugarcane-growing regions around the world and seriously threatens the development of the sugarcane industry. The establishment of rapid and effective detection methods to prevent and control SCSMV is of great significance. In this study， a pair of primers were synthesized based on the SCSMV P1 gene sequence， and the target gene with a size of 1 074 bp was amplified. The target gene was connected with the prokaryotic expression vector pET28a to obtain pET28a-P1SCSMV. The correct recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosetta strain. After induction by IPTG， SDS-PAGE electrophoresis showed that there was a band of the target protein at a molecular weight of about 42 kDa， which was consistent with the expected size of SCSMV P1. Fusion protein mainly existed in the form of soluble protein. The recombinant SCSMV P1 protein was obtained by affinity purification with a Ni2+-NTA column and healthy New Zealand white rabbits was immunized with recombinant SCSMV P1 protein to prepare rabbit antiserum. Western blot analysis showed that the prepared antiserum could specifically recognize the SCSMV P1 protein when testing multiple samples. The expression of P1 protein could be detected in sugarcane plants infected by SCSMV， but not in healthy plants. When the prepared antiserum was diluted to 1∶20 000， the target protein band could still be detected specifically. This suggested that the SCSMV antiserum prepared by expressing P1 in E.coli had strong specificity and high titer， which provides favorable conditions for rapid detection of SCSMV.

Key words Sugarcane streak mosaic virus; P1 protein; prokaryotic expression; antiserum

甘蔗線條花葉病毒Sugarcane streak mosaic virus（SCSMV）屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae禾草病毒屬Poacevirus，是引起甘蔗花葉病的主要病原之一[1]。SCSMV病毒于1978年由Gillaspie等在美國引自巴基斯坦的甘蔗種質上首次檢測到[2]。2008年-2011年，李世訪研究員團隊首次發(fā)現(xiàn)SCSMV在我國云南省甘蔗產(chǎn)區(qū)發(fā)生，后續(xù)調查發(fā)現(xiàn)SCSMV在云南省的主要甘蔗產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為頻繁，并且在某些地區(qū)出現(xiàn)了流行趨勢，對中國甘蔗產(chǎn)業(yè)構成嚴重威脅[3]。SCSMV是無包膜、彎曲線狀的病毒粒體，平均大小為890 nm×15 nm。SCSMV大小為10 kb左右，其外殼蛋白（coat protein， CP）包裹著正單鏈RNA基因組，其編碼一個多聚蛋白，經(jīng)水解酶酶切后分為10個成熟的蛋白質，從N端到C端依次是P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP，且在P3蛋白的氨基末端以+2移碼方式編碼一個額外的蛋白質P3N-PIPO （N-terminus of P3-pretty interesting Potyviridae ORF）[4]。

甘蔗與高粱作為重要的經(jīng)濟作物，在自然條件下都可被SCSMV侵染。此外，SCSMV也可通過人工接種的方式侵染高粱Sorghum bicolor、玉米Zea mays、御谷Pennisetum glaucum等禾本科植物[5]。甘蔗被SCSMV侵染后引起的花葉病癥狀與甘蔗花葉病毒Sugarcane mosaic virus（SCMV）和高粱花葉病毒Sorghum mosaic virus（SrMV）侵染造成的癥狀相似。SCSMV主要危害甘蔗葉片，甘蔗被侵染后，葉片上出現(xiàn)黃綠色條紋或斑駁癥狀，尤其是新葉受到的危害更嚴重;SCSMV能系統(tǒng)地侵染甘蔗，導致植株生長受損，分蘗減少，汁液量減少，口感變差，進而影響甘蔗產(chǎn)量和品質[6]。

常見的病毒檢測技術主要包括生物學檢測、分子生物學檢測以及血清學檢測等。生物學檢測的優(yōu)點在于可準確、直觀地體現(xiàn)病毒的生物學特性;分子生物學檢測具有精確度和靈敏度高的優(yōu)點，但其步驟較多，容易污染[78];血清學檢測的優(yōu)點主要是具有較高的靈敏度和準確度，操作簡單等，由于其步驟較繁瑣，在許多細節(jié)上需加以注意和改進才能在節(jié)省時間的同時得到背景較為清晰的條帶[9]。通過從病株汁液中提純得到的病毒制備抗血清不能完全排除寄主蛋白的影響，導致制備的抗血清檢測時易出現(xiàn)假陽性[10]。截至當前，對禾草病毒屬中11個蛋白的功能研究甚少，但對馬鈴薯Y病毒科病毒的研究已較明確。P1是一種絲氨酸型蛋白酶，通過自身剪切從多聚蛋白前體中分離出來。研究顯示它的變異性極高，這可能與病毒對不同宿主的廣泛適應性相關[11]。在禾草病毒屬成員中RNA 誘導的基因沉默能夠被 P1 有效抑制[12]。馬鈴薯Y病毒科的HC-Pro基因的原核表達載體已被構建，HC-Pro參與病毒基因組的翻譯和蛋白加工，能識別HC-Pro/P3特異切割位點，HC-Pro能夠抑制RNA沉默，且與P1共表達時能明顯增強沉默抑制功能[13]。因此，構建SCSMV P1基因的原核表達載體可以進一步研究HC-Pro基因功能并可更加方便地檢測SCSMV病毒。本研究在大腸桿菌中成功表達了SCSMV的P1蛋白，將其作為抗原免疫兔子，制備了兔抗血清。經(jīng)分析驗證，所制備的抗血清可用于SCSMV的檢測，并有較高的特異性和靈敏度，對于SCSMV的檢測與防治有著重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

pCa-SCSMV農(nóng)桿菌菌株由揚州大學園藝與植物保護學院植物病毒實驗室培育;原核表達載體pET28a以及大腸桿菌菌株DH5α、Rosetta均由本實驗室保存;限制性內切酶 （NcoⅠ、SacⅠ）、反轉錄酶M-MLV、dNTPs、5×M-MLV Buffer、RNA酶抑制劑、載體等購自寶生物工程（大連）有限公司;PCR儀購自ProFlex公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自康寧生命科學（吳江）有限公司;2×High-Fidelity Master Mix 購自擎科生物技術有限公司;2×Taq Master Mix、分子量標準購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 基因擴增及原核表達載體構建

根據(jù)pCa-SCSMV的P1基因設計1對引物，利用上游引物P1SCSMV-F （5′-CATGCCATGGCTACTATCACTAAG-3′，下劃線部分為NcoⅠ酶切位點）和下游引物P1SCSMV-R （5′-TCCGAGCTCGAATAAAA-TACTAAATCTTC-3′，下劃線部分為SacⅠ酶切位點）擴增SCSMV P1基因（1 074 bp）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，用NcoⅠ和SacⅠ雙酶切，與同樣用NcoⅠ和SacⅠ雙酶切的原核表達載體pET28a在16℃金屬浴中過夜連接。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌Escherichia coli DH5α。通過菌落PCR驗證，選取5個陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，所得序列利用DNAMAN、BioEdit和BLASTN等軟件進行序列比對和分析，從中選擇測序結果正確的克隆進行后續(xù)的研究，并將其命名為pET28a-P1SCSMV。

1.3 重組蛋白的表達和SDS-PAGE分析

將pET28a-P1SCSMV轉化大腸桿菌Rosetta。挑取單菌落于5 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min活化過夜，翌日將活化的菌液按1∶100接種于50 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)1.5 h （OD600為0.4～1），各取2 mL菌液，加入終濃度為1 mmol/L IPTG分別在28℃和37℃誘導表達4～6 h，以不加IPTG作為對照。取2 mL誘導產(chǎn)物離心收集菌體，加入200 μL蛋白懸浮緩沖液 （pH 6.8），振蕩混勻，吸取20 μL蛋白樣品并加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，在沸水中煮10 min，冰浴5 min，12 000 r/min離心20 min，取8 μL上清液進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，通過考馬斯亮藍R-250染色，分析融合蛋白的表達情況。

1.4 重組蛋白的可溶性分析

通過離心收集誘導表達4～6 h的菌體，利用雙蒸水重懸菌體，加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1 mmol/L，采用超聲波破碎菌體細胞后，分別收集離心20 min后的上清和沉淀，將沉淀重懸后進行SDS-PAGE電泳，對融合蛋白進行可溶性分析，觀察目的蛋白在上清和沉淀中的相對含量。

1.5 可溶性蛋白的Ni柱純化

將誘導表達的目的蛋白擴大培養(yǎng)至1 L，按照上述方法誘導表達4～6 h，1 000 r/min，離心5 min，收集菌體，用25 mL pH 6.8的蛋白懸浮緩沖液懸浮細胞，將懸浮液轉移至燒杯并加入1%的蛋白酶抑制劑，超聲波破碎至菌液透亮，懸浮液轉移到離心管中，4℃，12 000 r/min，離心30 min以上;取上清液，加入1% PMSF過0.5 μm濾膜并通過Ni2+-NTA親和層析柱進行純化，隨后加入蛋白緩沖液沖洗柱子5次，沖洗結束后，用pH 6.8的蛋白緩沖液（分別含60、80、100、200、300、400 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液）各洗脫5次，分別收集洗脫液，置于冰上。

1.6 抗血清制備

純化的重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻，通過皮下多點注射抗原的方法免疫新西蘭大白兔，抗原總注射量為2.0 mg，每次注射0.5 mg，共免疫3次，每次免疫間隔時間為7～10 d，免疫結束后，在新西蘭大白兔耳緣靜脈抽取0.5～1 mL的兔血，37℃靜置1 h，4℃靜置過夜，分離抗血清。血清中加入0.02%的疊碳化鈉于-80℃保存。

1.7 抗血清特異性檢測

利用Western blot檢測抗血清的特異性和靈敏程度。將誘導表達后的菌體進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后，用雙蒸水洗脫凝膠，隨后通過電轉移的方法將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上 （200 mA，100 min）;電轉結束后，取出硝酸纖維素膜放至1×TBST （20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5或8.0，150 mmol/L NaCl， 0.1% Tween-20）緩沖液中洗脫，隨即轉入10 mL封閉液（TBST+ 5% 脫脂奶粉）中，37℃封閉反應1 h或者4℃封閉過夜;封閉完成后直接在封閉液中加入1∶2 000的特異性抗血清，37℃一抗反應至少1 h，一抗反應結束后將硝酸纖維素膜放至1×TBST緩沖液中洗脫3次，每次10 min;洗脫結束，將硝酸纖維素膜加入用TBST稀釋 （1∶5 000）的AP-IgG二抗，37℃反應45 min;再用1×TBST洗脫3次，每次10 min;在避光條件下，將硝酸纖維素膜放至含有NBT（330 μg/mL）和BCIP （165 μg/mL）的堿性磷酸酯酶緩沖液中顯色至條帶清晰，取出硝酸纖維素膜并用雙蒸水漂洗3次，終止顯色反應。將晾干的膜進行掃描分析。

將所制得的抗血清進行梯度稀釋 （1∶1 000，1∶5 000， 1∶10 000， 1∶20 000），與病葉汁液進行免疫抗原反應，Western blot檢測分析抗血清的特異性和靈敏度。

2 結果與分析

2.1 原核表達載體的構建

經(jīng)過菌落PCR、雙酶切 （圖1）以及測序驗證，重組表達質粒pET28a-P1SCSMV構建成功。

2.2 SCSMV P1的誘導表達和SDS-PAGE分析

pET28a-P1SCSMV轉化的大腸桿菌DH5α經(jīng)過1 mmol/L的IPTG進行蛋白的誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測到42 kDa的蛋白條帶，與所預期的大小一致（圖2），表明pET28a-P1SCSMV在大腸桿菌中正確表達。剩余菌體通過超聲波細胞破碎儀破碎細胞，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，結果顯示融合蛋白主要是以可溶蛋白的形式存在。

2.3 抗血清特異性及樣品鑒定

RT-PCR檢測結果顯示，采集的7個樣品中除1號和5號樣品外，其余5個樣品均為陽性。表明2、3、4、6號和7號樣品被SCSMV所侵染。Western blot分析結果顯示，抗血清與SCSMV侵染的5個甘蔗葉片提取液有特異性免疫反應，而與健康甘蔗葉片1號和5號提取液無反應，這一結果與RT-PCR分析結果一致，證實了制備的SCSMV P1抗血清可用于該病毒的檢測且抗體有非常好的特異性，能夠應用于植物樣品的檢測。

2.4 抗血清靈敏度鑒定

通過Western blot對SCSMV侵染后的病汁液進行檢測，發(fā)現(xiàn)當抗血清稀釋到1∶20 000時仍然能夠特異地檢測到目的蛋白 （圖4），說明制備的抗血清具有較高的靈敏度。

3 討論

血清學方法作為一種重要的植物病毒檢測技術手段是不可或缺的[13]。目前，利用提純的病毒來作為抗原直接免疫動物獲得抗血清是抗血清制備中相對主流的一種方法[14]。植物病毒檢測過程中易出現(xiàn)假陽性是因為抗血清中常常會含有寄主蛋白的抗體[15]。因此，本研究通過原核表達SCSMV P1重組蛋白，利用純化的蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔獲得特異性高的P1抗血清。先前我們已經(jīng)構建出SCSMV CP蛋白的抗血清[16]，此前研究報道表明SCSMV CP蛋白與同樣引起甘蔗花葉病的甘蔗花葉病毒Sugarcane mosaic virus （SCMV）和高粱花葉病毒 Sorghum mosaic virus （SrMV）的CP蛋白存在血清學交叉反應[17]。因此，為了適應SCSMV遺傳進化過程以及避免CP蛋白血清學交叉反應影響SCSMV檢出效率，建立SCSMV P1特異性抗血清檢測方法對甘蔗線條花葉病毒的檢測進行補充和完備顯得格外重要。本試驗所獲得的P1抗血清特異性強，能夠高效特異的檢測SCSMV的發(fā)生，適用于田間生產(chǎn)上的檢測，為病毒的防治與研究提供了較為方便的條件。

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（責任編輯：楊明麗）