任躍英，牛 晨1,，王京京1,，楊 鶴1,，許永華1,*，劉 志*

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)人參新品種選育與開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118

引 言

人參(PanaxginsengC.A. Mey.)是五加科人參屬多年生藥用植物，人參肉質(zhì)根為著名的強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥，味甘、微苦，微溫，具有大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智之功效[1]。 人參在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品滋補(bǔ)藥物，具有“多服久服不傷身，輕身益氣不老延年”的作用[2]，其具有多種生物活性，包括抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老和抗疲勞等，同時(shí)亦有提高記憶力和改善心肌缺血損傷作用[3]。 人參含有多種化學(xué)成分, 包括人參皂苷、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮類、無(wú)機(jī)元素、維生素等物質(zhì)，而人參皂苷是人參中主要的活性成分，屬于三萜類皂苷，根據(jù)糖苷配基結(jié)構(gòu)不同分為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類和齊墩果酸型五環(huán)三萜類(主要包括Ro)[4]，達(dá)瑪烷型人參皂苷又根據(jù)其苷元不同分為原人參二醇型(PPD型，主要包括Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd)和原人參三醇型(PPT型，主要包括Rg1，Re和Rf)[5]。

人參育種工作已經(jīng)開(kāi)展了幾十年，但發(fā)展緩慢，是由于人參自身的某些特性所導(dǎo)致的[6]。 利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可使植物實(shí)現(xiàn)離體快繁，大大縮短育種時(shí)間。 在植物組織培養(yǎng)過(guò)程種，光是重要的影響因素之一。 有研究表明，光質(zhì)對(duì)植物的結(jié)構(gòu)發(fā)育及形態(tài)有很大的影響[7]，對(duì)于次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有促進(jìn)作用[8]，并且對(duì)完整植物和離體的植物組織均有影響[9]。 而光質(zhì)對(duì)于植物的影響會(huì)因植物種類的不同而產(chǎn)生不同的影響[10]。 目前，有關(guān)光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織皂苷含量影響還沒(méi)有相關(guān)研究。 本工作以人參愈傷組織為試驗(yàn)材料，探究光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中人參皂苷含量的影響，旨在提高人參皂苷含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料

人參采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥植園，愈傷組織由二年生人參越冬芽誘導(dǎo)而來(lái)。

1.2 方法

1.2.1 人參愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng)

取二年生人參越冬芽，先用流水沖洗4～6 h，除去泥土，再用洗潔精進(jìn)行表面清洗，后用濾紙吸干表面水分，放入干凈的組培瓶中轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)。 將人參越冬芽外植體用75%酒精消毒15～20 s，再用無(wú)菌水沖洗1次，0.1%升汞消毒10～15 min，無(wú)菌水沖洗4～5次。 人參愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，2,4-D 2.0 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1，pH 5.8。 培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度(25±2)℃，濕度60%。

1.2.2 不同光質(zhì)處理人參愈傷組織及其形態(tài)觀察

以培養(yǎng)4周且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人參愈傷組織為材料，接種至MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每瓶均勻接種5塊，每塊鮮重約0.2 g，每個(gè)處理30瓶，重復(fù)3次，共接種180 瓶。 將其平均分為 6 組，分別置于紅光、紅藍(lán)光、藍(lán)光、綠光、黃綠光、黑暗(CK)五 種不同光質(zhì)條件下培養(yǎng)。 不同光源技術(shù)參數(shù)如表1所示。 培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照時(shí)長(zhǎng)16 h·d-1，光照強(qiáng)度(200±10) μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)28 d，在第5，15，21，25和30 d時(shí)拍照、觀察并記錄其形態(tài)。

表1 不同LED光源技術(shù)參數(shù)Table 1 Different LED light source technical parameters

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

收獲培養(yǎng)28 d的人參愈傷組織，用濾紙吸干其表面水分，稱重，記為鮮重，后置于40 ℃烘箱中烘干至恒重，稱其重量記為干重，再用研缽研磨成粉末，過(guò)80目篩，保存?zhèn)溆谩?精密稱取0.1 g的樣品粉末，置于5 mL的離心管中，加入2.5 mL氨水-水-甲醇溶液(NH3+H2O+CH3OH=4+21+75，V:V), 封口膠封住管口，用混勻器混勻，超聲提取30 min(功率600 W，頻率35 kHz)，靜置48 h，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，用超高相液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。 每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用DPS對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，Excel 2019進(jìn)行圖形分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織形態(tài)的影響

不同光質(zhì)處理對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)及形態(tài)變化有明顯差異。 如圖1所示，藍(lán)光處理下人參愈傷組織最早出現(xiàn)發(fā)白現(xiàn)象，且邊緣產(chǎn)生灰色物質(zhì)[圖1(A1)]，處理第30 d時(shí)，愈傷組織逐漸呈灰白色，愈傷塊增大[圖1(A5)]；紅光處理下人參愈傷組織也出現(xiàn)變白現(xiàn)象，但程度低于藍(lán)光處理[圖1(B1)]，后又呈現(xiàn)黃白色，處理第30天時(shí)，與對(duì)照相比，紅光處理后的愈傷偏白，且有愈傷發(fā)生褐變，愈傷塊明顯縮小[圖1(B5)]；綠光處理下人參愈傷組織顏色發(fā)白，但次于其他光質(zhì)，但逐漸出現(xiàn)大面積的褐變愈傷，少部分仍呈白色[圖1(C5)]，可能是由于綠光能加速愈傷組織老化，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累；紅藍(lán)光處理下愈傷也呈現(xiàn)白色，但程度低于藍(lán)光而高于其他光質(zhì)，處理第30 d時(shí)，顏色偏灰褐色，且愈傷塊縮小，老化程度嚴(yán)重[圖1(D5)]。 黃綠光處理下人參愈傷組織初期無(wú)明顯的顏色變化，后亦發(fā)白，且邊緣有褐色物質(zhì)產(chǎn)生[圖1(E1)]，處理第30 d時(shí)，黃綠光處理后大部分愈傷呈白色，白色程度最顯著，強(qiáng)于其他光質(zhì)[圖1(E5)]；黑暗條件下人參愈傷組織偏黃，邊緣有紅色物質(zhì)產(chǎn)生，組織疏松，含水量大[圖1(F1)]，處理第28 d時(shí)，愈傷組織表面呈現(xiàn)紅褐色[圖1(F5)]。

圖1 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織形態(tài)的影響 A： 藍(lán)光；B: 紅光；C： 綠光；D： 紅藍(lán)光；E： 黃綠光；F： 黑暗(CK)；1，5分別代表第5天、第30天Fig.1 Effects of different light qualities on callus morphology of P.ginsengA: Blue light；B: Red light；C: green light；D: Red and blue light；E: Yellow and green light；F: Dark(CK); The numbers 1and 5 on the figures represent the treatment of the 5th and 30th day, respectively

2.2 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響

不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)影響如圖2所示。 與對(duì)照相比，藍(lán)光對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其他光質(zhì)對(duì)愈傷組織鮮重積累呈不同程度的抑制作用，但與對(duì)照相比差異都不顯著(p>0.05)；除藍(lán)光外，其他光質(zhì)對(duì)鮮重影響均低于對(duì)照，但其干重均略高于對(duì)照，分析原因可能是由于折干率不同，且不同光質(zhì)的折干率與對(duì)照相比差異顯著(p<0.05)。 由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)藍(lán)光處理，愈傷組織的鮮重、干重均達(dá)到最大，說(shuō)明藍(lán)光對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)起到較好的促進(jìn)作用，但彼此之間差異不顯著(p>0.05)。

圖2 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)的影響

2.3 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中PPD、PPT型、齊墩果酸型人參皂苷和總皂苷含量的影響

不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中PPD、PPT型 、齊墩果酸型人參皂苷和總皂苷的影響見(jiàn)表2，其中a—d表示不同光質(zhì)處理樣品中皂苷含量差異的顯著性(p<0.05)，若字母相同則表示差異不顯著(下同)。 由表2可知，不同光質(zhì)處理后人參愈傷組織中PPD型、PPT型、齊墩果酸型人參皂苷和總皂苷含量多數(shù)低于對(duì)照，且與對(duì)照差異顯著(p<0.05)；但相比其他光質(zhì)，綠光處理后PPD型、PPT型、齊墩果酸型人參皂苷和總皂苷含量均較高；藍(lán)光、紅藍(lán)光、黃綠光處理后齊墩果酸型人參皂苷消失，而紅光、綠光處理后其明顯減少；藍(lán)光、紅藍(lán)光、黃綠光處理后PPD型、PPT型人參皂苷和總皂苷含量極低；但經(jīng)過(guò)藍(lán)光、紅藍(lán)光、黃綠光處理后PPT型人參皂苷含量略高于PPD型皂苷含量，其中藍(lán)光和紅藍(lán)光導(dǎo)致的變化最為凸顯，黃綠光導(dǎo)致的變化不明顯；綠光處理后總皂苷略低于對(duì)照，而PPT型人參皂苷略高于對(duì)照，但彼此差異都不顯著(p>0.05)。 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中總皂苷含量的影響依次為黑暗>綠光>紅光>黃綠光>藍(lán)光>紅藍(lán)光；對(duì)PPD型人參皂苷的影響依次為黑暗>綠光>紅光>黃綠光>藍(lán)光>紅藍(lán)光；對(duì)PPT型人參皂苷的影響依次為黑暗>綠光>紅光>黃綠光>紅藍(lán)光>藍(lán)光；對(duì)齊墩果酸型人參皂苷的影響均較弱。 紅光和綠光對(duì)人參皂苷作用不明顯，而藍(lán)光、紅藍(lán)光、黃綠光對(duì)人參皂苷合成卻起到明顯的抑制作用。

表2 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中PPD、PPT型、齊墩果酸型人參皂苷和總皂苷的影響

2.4 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中9種皂苷單體含量的影響

采用超高效液相色譜法測(cè)定不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中9種皂苷單體含量的影響，結(jié)果如表3所示。 不同光質(zhì)處理對(duì)人參愈傷組織中Rb3的含量無(wú)影響，均未檢測(cè)到Rb3的存在；藍(lán)光、紅藍(lán)光、黃綠光處理后9種皂苷類成分含量偏低，甚至檢測(cè)不到Rf，Ro和Rc的存在；與對(duì)照相比，綠光處理后Rg1和Rf含量均偏高，此時(shí)含量分別為4.063和1.194 mg·g-1，對(duì)Rg1和Rf人參皂苷單體含量有促進(jìn)作用，Rg1變化差異顯著(p<0.05)，但Rf之間差異不顯著(p>0.05)；相比藍(lán)光、紅藍(lán)光、黃綠光，紅光和綠光處理后人參皂苷單體含量較高，且綠光優(yōu)于紅光；總之，紅光、藍(lán)光、綠光、紅藍(lán)光、黃綠光處理對(duì)人參皂苷含量的影響均不如黑暗處理。

近年來(lái)，已有不少學(xué)者研究光對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、植株再生、誘導(dǎo)生根、組培苗生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累等方面的影響，光照雖不是愈傷組織生長(zhǎng)的必要條件，但在愈傷組織誘導(dǎo)分化、次生代謝產(chǎn)物積累方面卻起著重要的作用，而光質(zhì)、光照強(qiáng)度、光照周期是影響愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累的主要因素。 魏喜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，紅藍(lán)混合光有利于棉花愈傷組織的誘導(dǎo)分化。 劉生財(cái)?shù)萚12]也曾報(bào)道紅藍(lán)復(fù)合光有利于龍眼胚性愈傷組織中類黃酮及表兒茶素合成，且藍(lán)光比例越大越有利于次生代謝物質(zhì)的合成。 相比田間栽培，植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)，也是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物最有效的方法之一。 不同光質(zhì)作為外界因素，會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生直接影響，導(dǎo)致其生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生改變，引起細(xì)胞體系的改變，從而對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累產(chǎn)生影響。 本工作以愈傷組織為材料，探究不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中9種人參皂苷單體及總皂苷含量的變化。 結(jié)果表明，不同光質(zhì)處理后人參愈傷組織中PPD型、PPT型、齊墩果酸型人參皂苷和總皂苷含量均低于對(duì)照，紅光和綠光對(duì)人參皂苷含量作用不明顯，且藍(lán)光、紅藍(lán)光、黃綠光對(duì)人參中主要皂苷類成分起到明顯的抑制作用。 推測(cè)可能因不同光質(zhì)都是由具有相對(duì)能量的光線組成的，會(huì)產(chǎn)生一定熱量，從而使愈傷組織表面溫度升高，而高溫高壓的環(huán)境會(huì)使人參皂苷發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化，可能會(huì)生成其他皂苷類成分或增加人參總糖含量，謝麗娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，溫度較高(>30 ℃)，會(huì)使人參失去部分糖基，易水解成原人參二醇、原人參三醇或其他的次生苷。 高越等[14]也證實(shí)了高溫會(huì)降低Rg1，Re和Rb2人參皂苷單體的含量。 而且愈傷組織是由未分化的原始細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成的，沒(méi)有正常人參植株那么復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，降低了轉(zhuǎn)化時(shí)的結(jié)構(gòu)障礙，使得人參皂苷單體之間更易相互轉(zhuǎn)化。

表3 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中9種皂苷類成分含量的影響Table 3 Contents of 9 kinds of individual ginsenosides in P.ginseng callus by different light qualities

3 結(jié) 論

光質(zhì)處理會(huì)影響人參愈傷組織形態(tài)及生物量，綠光會(huì)加速人參愈傷組織老化，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物積累，而藍(lán)光對(duì)人參愈傷組織生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。 在對(duì)人參愈傷組織中9種人參皂苷成分的研究中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光、紅藍(lán)光、黃綠光處理后9種皂苷類成分含量極低；與對(duì)照相比，綠光處理后Rg1、Rf含量均偏高，對(duì)Rg1、Rf人參皂苷單體形成有促進(jìn)作用；相比藍(lán)、紅藍(lán)、黃綠三種光質(zhì)，紅光和綠光處理后人參皂苷單體含量較高，且綠光優(yōu)于紅光；總之，紅光、藍(lán)光、綠光、紅藍(lán)光、黃綠光處理對(duì)人參皂苷含量的影響均不如對(duì)照。

綜上所述，綠光會(huì)加速人參愈傷組織老化，而藍(lán)光會(huì)促進(jìn)人參愈傷組織生長(zhǎng)。 不同光質(zhì)對(duì)人參愈傷組織中總皂苷及9種單體皂苷類成分的影響有所不同，綠光對(duì)Rg1、Rf人參皂苷單體含量有促進(jìn)作用，并且其含量與光質(zhì)所具能量高低有一定關(guān)系。 從光照的角度出發(fā)，對(duì)如何提高人參皂苷含量的方法還有待進(jìn)一步深究。