戚利坤，王巍

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率均居所有惡性腫瘤的前列［1-2］。目前，胃癌患者的5年總體生存率仍不足40%，術(shù)后的局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移依然是胃癌臨床治療亟待解決的問題［3-4］。尋找胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標志物對于患者的預(yù)后預(yù)測及后續(xù)治療策略的制定具有重要的臨床意義。腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白（TNFαIP）是由腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白家族，包括TNFαIP1、TNFαIP3、TNFαIP4、TNFαIP6、TNFαIP8 等［5］。研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白參與了包括炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細胞增殖、凋亡、細胞黏附等多種生物學進程，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色［6-7］。有研究發(fā)現(xiàn)，TNFαIP6 高表達與炎癥性腸病的活動性及組織損傷程度有關(guān)［8-9］。基于腫瘤微環(huán)境中炎癥反應(yīng)與癌癥之間的密切聯(lián)系［10］，筆者推測TNFαIP6可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究通過免疫組化染色觀察TNFαIP6蛋白在胃癌組織中的表達情況，分析TNFαIP6 表達與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在揭示其在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用及對預(yù)后的預(yù)測價值，為胃癌的分子靶向治療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015 年6 月—2019 年1 月青海省腫瘤醫(yī)院收治并行手術(shù)治療的133例胃癌患者作為研究對象。所有患者術(shù)后經(jīng)組織病理學證實為原發(fā)性胃腺癌，術(shù)前未行任何治療。收集患者術(shù)后的組織標本，腫瘤組織于癌中心部位取材，癌旁組織取胃癌組織周邊5 cm以外的正常胃黏膜。收集胃癌患者的一般資料及臨床病理特征，包括年齡、性別、腫瘤直徑、組織學分化類型、Borrmann 分型、腫瘤TNM 分期、血管侵犯、神經(jīng)浸潤。本研究的設(shè)計與實施經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者均簽署告知同意書，明確手術(shù)標本的使用目的。

1.2 免疫組化染色檢測TNFαIP6 表達 將胃癌組織標本連續(xù)切片制成4μm厚度的組織薄片，依次進行脫蠟、梯度乙醇脫水、抗原修復(fù)及去除內(nèi)源性過氧化物酶。切片使用山羊血清封閉后，加入兔抗人TNFαIP6 單克隆抗體（1∶200，購自美國Santa Cruz）于4 ℃下孵育過夜；次日使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗切片3 次，二抗孵育后進行DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察染色強度及染色細胞的比例。隨機讀取4個高倍視野，以染色陰性或染色不清為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；同時，計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞百分比，染色陽性細胞百分比＜5%計0 分，5%~25%計1 分，26%~50%計2 分，51%~75%計3 分，＞75%計4 分。TNFαIP6 在胃癌組織中的免疫組化評分基于染色強度與染色細胞比例得分的乘積，總分＜4 分為低表達，≥4 分為高表達。

1.3 隨訪 所有患者于術(shù)后定期至我院門診進行復(fù)查，具體項目包括：血清腫瘤標志物測定及胸、腹、盆腔CT 檢查，每3個月1 次；胃鏡，每年1 次，以監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。術(shù)后隨訪通過電話及查閱病歷等方式進行，末次隨訪時間為2020年7月，全部病例無失訪，中位隨訪時間為45.3個月（2~61個月）。本研究的主要終點事件為總體生存期（overall survival，OS），即自手術(shù)之日起至末次隨訪或因任何原因死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制TNFαIP6 高表達與低表達患者的生存曲線，2 組患者的生存率差異采用Log-rank檢驗。采用Cox風險比例回歸模型評估胃癌患者預(yù)后的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床病理情況 133例患者中男83例（62.4%），女50例（37.6%）；患者年齡34~90歲，平均（63.7±10.1）歲；中高分化腺癌69例，低分化腺癌64例；T1~T2 期71例，T3~T4 期62例；64例（48.1%）存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，9例（6.8%）在診斷時已存在遠處轉(zhuǎn)移；血管侵犯與神經(jīng)浸潤的發(fā)生率分別為54.1%（72∕133）和16.5%（22∕133）。

2.2 不同臨床特征患者的TNFαIP6 表達水平比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，TNFαIP6 在胃癌組織中呈明顯陽性表達，以胞漿表達為主，呈彌漫性分布，而在癌旁組織中則多呈陰性表達或弱陽性表達，見圖1?；诿庖呓M化染色評分，133例患者中TNFαIP6 低表達81例，高表達52例。低分化腺癌、Borrmann Ⅳ型、T3~T4期、M1期、血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TNFαIP6高表達的比例更高，見表1。

Fig.1 The expression of TNFαIP6 in gastric cancer and adjacent normal tissues detected by immunohistochemistry(×400)圖1 免疫組化檢測TNFαIP6在胃癌及癌旁組織中的表達（×400）

2.3 不同TNFαIP6 表達水平患者的生存分析結(jié)果 隨訪期內(nèi)，共31例患者死亡，Kaplan-Meier 生存曲線顯示，TNFαIP6 高表達與低表達患者5 年總生存率分別為56.5%和82.9%，差異有統(tǒng)計學意義（Log-rankχ2=12.404，P＜0.01），見圖2。

2.4 胃癌患者預(yù)后的影響因素分析 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑、Borrmann Ⅳ型、T分期、N分期、M分期、血管侵犯、神經(jīng)浸潤及TNFαIP6表達情況均為胃癌患者預(yù)后的影響因素，見表2。選取T分期、M 分期、TNFαIP6 表達情況納入多因素Cox 回歸分析，結(jié)果表明T3～T4期、M1期及TNFαIP6高表達是胃癌患者死亡的危險因素，見表3。

Tab.1 Comparison of TNFαIP6 high expression ratio in gastric cancer patients between different clinicopathological characteristics表1 不同臨床病理特征的胃癌患者TNFαIP6高表達比例比較 ［例（%）］

3 討論

腫瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后不佳的主要原因，尋找、認定胃癌患者預(yù)后相關(guān)的分子標志物對于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制具有重要的意義。本研究通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，TNFαIP6 在胃癌組織中呈明顯陽性表達，且TNFαIP6高表達與胃癌一系列侵襲性的臨床病理特征如低分化腺癌、Borrmann Ⅳ彌漫型胃癌、更深的腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管侵犯及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TNFαIP6 可能參與了胃癌的發(fā)生與進展。生存分析及回歸分析進一步表明，TNFαIP6 高表達患者生存時間縮短，高表達者死亡風險是低表達者的2.742倍，提示患者預(yù)后不佳。

Fig.2 The Kaplan-Meier curves of patients with high and low expression levels of TNFαIP6圖2 TNFαIP6高表達與低表達患者的生存曲線

Tab.2 Univariate Cox regression analysis on prognosis of gastric cancer patients表2 影響胃癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析

Tab.3 The multivariate Cox regression analysis identified independent predictors of the prognosis of gastric cancer patients表3 影響胃癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

TNFAIP6 基因位于人類染色體2q23.3，TNFαIP主要分布于細胞外，是一類由TNF-α、干擾素γ、白細胞介素-1 等炎性細胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥相關(guān)蛋白［6，11］。既往研究發(fā)現(xiàn)，TNFαIP6在包括炎癥性腸病［8］、風濕性性關(guān)節(jié)炎［12］等多種炎性疾病中呈明顯異常表達。近年一些研究報道了TNFαIP6在實體腫瘤中的致癌作用，進一步揭示了腫瘤微環(huán)境中的炎性細胞、炎癥因子及信號分子與惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。Chan 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，TNFαIP6 蛋白在尿路上皮癌中呈明顯陽性表達，其高表達與進展的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤、血管侵犯及高有絲分裂率顯著相關(guān)，是尿路上皮癌患者不良預(yù)后的獨立預(yù)測因素。Rachidi 等［14-15］報道TNFαIP6 蛋白在結(jié)腸癌、卵巢癌組織中的表達較癌旁正常組織明顯升高，是患者預(yù)后不良的標志。這些研究結(jié)果說明TNFαIP6 可能在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，而檢測TNFαIP6 的表達可能有助于腫瘤患者的預(yù)后評估及治療策略的制定。目前越來越多的證據(jù)表明，進展期胃癌患者可以從術(shù)后的輔助化療中獲益，降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，改善長期生存結(jié)局［16-17］。本研究結(jié)果揭示，低分化腺癌、Borrmann Ⅳ型胃癌、T3~T4期腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯者TNFαIP6高表達的比例更高。同時，TNFαIP6 高表達患者也更易發(fā)生遠隔器官轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差。對于TNFαIP6 高表達的胃癌患者，更加積極的輔助治療與密切的術(shù)后隨訪策略必不可少。

目前，已有多項研究證實，慢性炎癥反應(yīng)在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色［18-20］。作為一種炎癥相關(guān)因子，TNFαIP6 可能通過激活炎癥細胞，募集炎癥信號分子參與了腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)，進而促進了腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。近 期Zhang 等［21］發(fā) 現(xiàn)，下 調(diào) 人 胃 癌 細 胞AGS 與MKN28中TNFAIP6表達能夠顯著抑制細胞增殖、侵襲與遷移能力，揭示了TNFAIP6 基因?qū)ξ赴┘毎麗盒陨飳W行為的作用。然而，到目前為止，關(guān)于TNFAIP6基因影響胃癌細胞增殖、侵襲、遷移的具體分子機制仍然沒有被闡明。

綜上，TNFαIP6 在胃癌組織中的陽性表達與腫瘤的侵襲性特征顯著相關(guān)，是影響胃癌患者預(yù)后的一個獨立預(yù)測標志物。TNFαIP6可能作為癌基因參與胃癌的發(fā)生與進展，其對胃癌生物學行為的影響及可能涉及的分子機制需要進一步研究探索。