翟鑫祥，董輝，王晶，王永祥

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是指絕經(jīng)后女性由于缺乏雌性激素所致的骨吸收增加、骨組織微結(jié)構(gòu)改變、骨骼脆性增強(qiáng)且具有較高骨折風(fēng)險(xiǎn)的一種疾?。?］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥所致骨折與外力所致骨折存在差異，前者不但愈合緩慢，而且愈合質(zhì)量較差，還具有較高的畸形愈合風(fēng)險(xiǎn)［2］?？构俏账幬?、骨干細(xì)胞再生技術(shù)對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥療效顯著，而成骨細(xì)胞在骨重建過程中發(fā)揮重要作用［3-4］。黃芪多糖是黃芪的主要藥用活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫力和抗病毒、抗衰老、抗腫瘤功效，對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化功能和骨代謝有調(diào)節(jié)作用［5-6］，但有關(guān)黃芪多糖治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥方面的研究報(bào)道較少。本研究旨在探討黃芪多糖預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75 只SPF 級(jí)雌性3 月齡SD 大鼠，體質(zhì)量（270±20）g，購(gòu)自湖北天勤生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK（蘇）2017-0007。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所為SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房，溫度20~25 ℃、濕度50%~55%、人工光照12 h∕d，使用許可證號(hào)為SYXK（蘇）2017-0044，大鼠自由飲水和進(jìn)食。本研究遵守3R原則，并通過醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20191019）。

1.2 主要試劑和儀器 鈣定試劑盒（上海捷門生物技術(shù)合作公司），全反式維甲酸（ATRA，上海信帆生物科技有限公司），Triton X-100、黃芪多糖、雌二醇（上海梵態(tài)生物科技有限 公 司），MTT Kit（Ybscience），堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢益普生物科技有限公司），骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）ELISA 試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司），骨鈣素（bone gla protein，BGP）ELISA試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）ELISA試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司），兔抗鼠核因子E2 相關(guān)因子（nuclear factor E2 related factor，Nrf2）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）抗體（上海鈺博生物科技有限公司），兔抗鼠血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（kl584Mu01，上?？道噬锟萍加邢薰荆?-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），GAPDH抗體（武漢菲恩生物科技有限公司），成骨誘導(dǎo)液（百致生物醫(yī)藥科技上海有限公司），PC201柱式動(dòng)物組織∕細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司）。多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax iD3，美國(guó)Molecular Devices），X 線小動(dòng)物骨密度儀（Ultra Focus DXA，美國(guó)Faxitron）。

1.3 研究方法

1.3.1 骨質(zhì)疏松癥模型大鼠制備及分組 參考文獻(xiàn)［7］，對(duì)60 只3 月齡雌性SD 大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，制備骨質(zhì)疏松癥模型。60只大鼠均造模成功，并按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（雌二醇組）、黃芪多糖組、黃芪多糖+ARTA組，每組15只；另取15只3月齡雌性SD 大鼠為假手術(shù)組，只進(jìn)行卵巢周圍脂肪組織切除，不摘除卵巢。

1.3.2 藥物干預(yù) 術(shù)后1周，雌二醇組大鼠以雌二醇（0.1 mg∕kg）灌胃，黃芪多糖組以黃芪多糖（20 mg∕kg）灌胃［8］，黃芪多糖+ARTA組以黃芪多糖（20 mg∕kg）和ARTA（7 mg∕kg）灌胃［9］，模型組和假手術(shù)組以等體積生理鹽水灌胃；各組干預(yù)均1次∕d，連續(xù)8周。

1.3.3 大鼠脛骨骨密度、骨礦量和生物力學(xué)性質(zhì)測(cè)定 末次給藥后24 h，隨機(jī)抽取8只大鼠，用X線小動(dòng)物骨密度儀檢測(cè)各組大鼠脛骨骨密度、骨礦量；檢測(cè)后麻醉處死大鼠，分離右側(cè)脛骨，三點(diǎn)彎曲法［10］檢測(cè)脛骨生物力學(xué)性質(zhì)（最大載量、斷裂能）。

1.3.4 BMSCs 分離、培養(yǎng) 分離大鼠股骨，并與1.3.3 中分離所得余下脛骨一起使用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗干凈，全骨髓貼壁培養(yǎng)法［11］進(jìn)行BMSCs 培養(yǎng)、傳代和鑒定，取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞活性 將1.3.4中的BMSCs以細(xì)胞密度為2×104∕mL、100μL∕孔接種于96孔板，采用成骨誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)6 d，加入100μL 0.5 g∕L MTT溶液，孵育4 h，棄上清液，加入200μL DMSO孵育0.5 h，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的光密度（OD）值。每組重復(fù)6次。

1.3.6 ALP 活性及鈣沉積量檢測(cè) 將1.3.4 中的BMSCs 以細(xì)胞密度2×105∕mL、250μL∕孔接種于24孔板，成骨誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)6 d，將細(xì)胞溶解于0.1% Triton X-100，采用Bradford 法檢測(cè)ALP 活性；成骨誘導(dǎo)28 d 時(shí)，鄰甲酚酞絡(luò)合酮法［12］檢測(cè)鈣沉積量。

1.3.7 成骨細(xì)胞中BMP2、BGP、OPG、SOD、MDA水平檢測(cè) 取經(jīng)過1.3.5骨誘導(dǎo)6 d后的各組細(xì)胞，3 500 r∕min 離心20 min，取上清液，ELISA 檢測(cè)BMP2、BGP、OPG、SOD、MDA 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。每組重復(fù)6次。

1.3.8 Western blot 檢測(cè)Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá) 提取BMSCs 成骨誘導(dǎo)液作用21 d 后的細(xì)胞總蛋白，使用Bradford法調(diào)整各組細(xì)胞蛋白濃度使其一致，依次經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF 膜、密封2 h，加入Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH一抗（均1∶500）4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶500）孵育1 h，曝光顯影后，使用IMAGE J 圖像處理軟件分析蛋白條帶灰度值，統(tǒng)計(jì)條帶相對(duì)灰度值。每組重復(fù)6次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 和SigmaStat 4.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度、骨礦量及生物力學(xué)性質(zhì)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度、骨礦量、最大載量和斷裂能均降低（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組大鼠骨密度、骨礦量、最大載量和斷裂能均升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA組大鼠骨密度、骨礦量、最大載量和斷裂能均降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of bone mineral density,bone mineral content and biomechanical properties between the five groups of rats表1 各組大鼠骨密度、骨礦量及生物力學(xué)性質(zhì)的比較（n=8，±s）

Tab.1 Comparison of bone mineral density,bone mineral content and biomechanical properties between the five groups of rats表1 各組大鼠骨密度、骨礦量及生物力學(xué)性質(zhì)的比較（n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與黃芪多糖組比較，P＜0.05；表2-5同。

組別假手術(shù)組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F骨密度（g∕cm3）0.33±0.02 0.21±0.02a 0.32±0.03b 0.29±0.03b 0.23±0.04c 27.429＊＊骨礦量（g）2.13±0.35 0.84±0.12a 1.83±0.23b 1.75±0.25b 1.27±0.18c 36.400＊＊最大載量（N）90.34±6.28 61.02±8.31a 83.43±5.67b 79.84±6.41b 69.61±6.07c 24.578＊＊斷裂能（mJ）24.93±3.26 11.09±2.52a 21.53±2.97b 18.36±2.72b 15.13±2.64c 28.975＊＊

2.2 各組大鼠成骨細(xì)胞活性、ALP 活性及鈣沉積量比較 與假手術(shù)組比較，模型組成骨細(xì)胞活性、ALP活性及鈣沉積量均降低（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組成骨細(xì)胞活性、ALP活性及鈣沉積量均升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA 組成骨細(xì)胞活性、ALP 活性及鈣沉積量均降低（P＜0.05），見表2。

2.3 各組大鼠成骨細(xì)胞中BMP2、BGP、OPG 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組BMP2、BGP、OPG水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組BMP2、BGP、OPG 水平均升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA組BMP2、BGP、OPG水平均降低（P＜0.05），見表3。

2.4 各組大鼠成骨細(xì)胞中SOD、MDA水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組SOD 活性降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA 組SOD 活性降低，MDA水平升高（P＜0.05），見表4。

Tab.2 Comparison of osteoblast activity,ALP activity and calcium deposition between the five groups of rats表2 各組大鼠成骨細(xì)胞活性、ALP活性及鈣沉積量比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of osteoblast activity,ALP activity and calcium deposition between the five groups of rats表2 各組大鼠成骨細(xì)胞活性、ALP活性及鈣沉積量比較（n=6，±s）

組別假手術(shù)組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F成骨細(xì)胞活性（OD值）0.47±0.10 0.21±0.04a 0.42±0.04b 0.39±0.05b 0.30±0.03c 19.283＊＊ALP活性（U∕L）29.53±3.36 20.42±2.85a 28.69±3.01b 27.31±3.24b 23.36±2.80c 9.521＊＊鈣沉積量（μg∕g）106.92±5.28 52.36±4.85a 98.36±5.67b 87.36±6.31b 71.66±6.07c 88.663＊＊

Tab.3 Comparison of BMP2,BGP and OPG in osteoblasts between the five groups of rats表3 各組大鼠成骨細(xì)胞中BMP2、BGP、OPG水平比較（n=6，μg∕L，±s）

Tab.3 Comparison of BMP2,BGP and OPG in osteoblasts between the five groups of rats表3 各組大鼠成骨細(xì)胞中BMP2、BGP、OPG水平比較（n=6，μg∕L，±s）

組別假手術(shù)組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F BMP2 10.47±1.53 6.36±1.04a 9.15±1.27b 8.68±1.18b 7.12±1.05c 10.673＊＊BGP 24.35±2.68 17.26±2.14a 22.39±2.15b 21.86±2.53b 18.94±1.08c 10.057＊＊OPG 6.92±1.05 2.21±0.54a 5.93±0.96b 5.36±1.03b 3.72±0.67c 27.360＊＊

Tab.4 Comparison of oxidation indexes in osteoblasts between the five groups of rats表4 各組大鼠成骨細(xì)胞中SOD、MDA水平比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of oxidation indexes in osteoblasts between the five groups of rats表4 各組大鼠成骨細(xì)胞中SOD、MDA水平比較（n=6，±s）

組別假手術(shù)組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F SOD（U∕L）41.56±6.35 16.31±4.19a 37.25±5.73b 38.72±6.24b 24.64±5.92c 21.130＊＊MDA（mmol∕L）10.53±1.39 31.63±3.63a 16.36±2.15b 11.31±1.52b 22.13±2.48c 81.222＊＊

2.5 各組大鼠成骨細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組Nrf2、HO-1、NQO1 相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、黃芪多糖組成骨細(xì)胞Nrf2、HO-1、NQO1 相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+ARTA 組Nrf2、HO-1、NQO1 相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖1、表5。

3 討論

絕經(jīng)后女性由于卵巢功能減退，雌激素水平減低，體內(nèi)骨轉(zhuǎn)化率加快，導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥［13］。構(gòu)建動(dòng)物模型探究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制及防治措施為常用研究方法，其中去勢(shì)法是較為成熟、有效的建模方式。本研究結(jié)果顯示，在造模的同時(shí)給予大鼠黃芪多糖灌胃干預(yù)可以明顯改善其骨密度、骨礦量、最大載量及斷裂能，且其干預(yù)效果與雌二醇接近，表明黃芪多糖具有抗骨質(zhì)疏松的作用，而使用Nrf2信號(hào)通路抑制劑ATRA處理后，骨密度、骨礦量、最大載量及斷裂能明顯低于黃芪多糖干預(yù)的大鼠，提示黃芪多糖可能通過介導(dǎo)Nrf2途徑來發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。董重陽(yáng)等［14］研究亦得到相近結(jié)論。

Fig.1 Relative expression levels of Nrf2,HO-1 and NQO1 in osteoblasts of each group圖1 各組大鼠成骨細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1相對(duì)表達(dá)水平

Tab.5 Relative expression levels of Nrf2,HO-1 and NQO1 in osteoblasts of each group表5 各組大鼠成骨細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1相對(duì)表達(dá)水平 （n=6，±s）

Tab.5 Relative expression levels of Nrf2,HO-1 and NQO1 in osteoblasts of each group表5 各組大鼠成骨細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1相對(duì)表達(dá)水平 （n=6，±s）

組別假手術(shù)組模型組雌二醇組黃芪多糖組黃芪多糖+ARTA組F Nrf2 0.91±0.13 0.13±0.02a 0.56±0.07b 2.37±0.28b 0.57±0.05c 216.640＊＊HO-1 0.71±0.18 0.16±0.03a 0.63±0.15b 2.86±0.31b 0.47±0.08c 220.846＊＊NQO1 0.82±0.15 0.08±0.02a 0.73±0.12b 2.16±0.23b 0.32±0.05c 210.460＊＊

骨形成和骨吸收之間的平衡是保持骨組織正常的關(guān)鍵所在。本研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠BMSCs 的增殖活性、ALP 活性以及鈣沉積量較假手術(shù)組明顯降低，表明雌激素缺乏會(huì)增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，而抑制成骨細(xì)胞活性，雌二醇干預(yù)后成骨細(xì)胞活性、ALP活性以及鈣沉積量均增強(qiáng)，黃芪多糖干預(yù)結(jié)果與雌二醇干預(yù)結(jié)果相近，此結(jié)果與楊九杰等［15］部分研究結(jié)果趨勢(shì)相似。本研究中給予黃芪多糖+ATRA 干預(yù)后，大鼠成骨細(xì)胞增殖活性、ALP 酶活性以及鈣沉積量降低，進(jìn)一步證實(shí)了黃芪多糖可能通過Nrf2 信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞增殖活性，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

BMPs 作為骨基質(zhì)中大量存在的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族的一員，主要促進(jìn)未分化間充質(zhì)細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞向骨系細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮促進(jìn)骨折愈合的作用［16］。BGP 也稱為骨鈣蛋白，是反映骨形成的特異性生化指標(biāo)，主要發(fā)揮維持骨正常鈣化速率、抑制軟骨的鈣化速度和抑制骨異常的作用，能夠直接反映骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)骨細(xì)胞活性以及骨形成情況。OPG是由成骨細(xì)胞和骨髓間質(zhì)細(xì)胞等分泌的一類多肽鏈，通過與破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵因子結(jié)合，抑制骨吸收，從而增加皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨密度，并提高骨強(qiáng)度。本研究結(jié)果顯示，模型組成骨細(xì)胞中BMP2、BGP、OPG 水平較假手術(shù)組降低，雌二醇、黃芪多糖干預(yù)后均可逆轉(zhuǎn)上述趨勢(shì)，但在黃芪多糖基礎(chǔ)上給予ATRA 干預(yù)又會(huì)改變這種趨勢(shì)，表明在小鼠體內(nèi)BMP2被抑制時(shí)，會(huì)使成骨細(xì)胞的增殖及分化受到抑制，發(fā)生骨質(zhì)疏松，BMP2 在骨質(zhì)疏松的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，提示黃芪多糖能夠通過影響成骨細(xì)胞功能活性來發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生及清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，此時(shí)破骨細(xì)胞能夠產(chǎn)生適量的自由基產(chǎn)物加速組織鈣化，從而促進(jìn)骨重建［17］。雌激素缺乏會(huì)抑制抗氧化酶活性，清除ROS的能力降低，破骨細(xì)胞產(chǎn)生的自由基產(chǎn)物會(huì)在細(xì)胞水平上產(chǎn)生一系列氧化損傷，抑制大部分細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)及增殖過程［18］。本研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠成骨細(xì)胞中SOD活性降低，MDA水平升高，表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)較嚴(yán)重，而黃芪多糖干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)上述趨勢(shì)，可能因?yàn)辄S芪多糖本身就是一種有效的自由基清除劑［19］，能夠通過降低ROS水平，減輕ROS對(duì)SOD活性的抑制作用，同時(shí)減少過量ROS對(duì)脂膜的攻擊，從而降低MDA 水平。Nrf2是一種重要的抗過氧化反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，Nrf2 能夠迅速地磷酸化激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，通過作用下游ARE 蛋白，促進(jìn)HO-1、SOD、NQO1 等抗氧化蛋白表達(dá)［20］。HO-1 作為Nrf2 的下游靶蛋白，可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷［21］。NQO1 則是一類黃素蛋白酶，通過催化胞內(nèi)雙電子還原反應(yīng)，進(jìn)而解除醌類物質(zhì)的細(xì)胞毒性，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞和器官保護(hù)作用［22］。本研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠成骨細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)水平較假手術(shù)組降低，黃芪多糖干預(yù)后的Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高，表明黃芪多糖可能是通過激活Nrf2信號(hào)途徑，誘導(dǎo)抗氧化蛋白表達(dá)，從而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)骨組織。

綜上所述，黃芪多糖可促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的抗氧化酶合成分泌、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能活性，從而緩解骨質(zhì)疏松，其作用機(jī)制可能與激活Nrf2信號(hào)通路有關(guān)。