吳麗蘭 兆豐華生物科技(福州)有限公司 福州 350014

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是危害養(yǎng)豬業(yè)的一個重大傳染病，傳播能力強，主要引起母豬的繁殖障礙， 仔豬斷乳前后高病死率以及育成豬的呼吸道疾病[1]。 該病主要是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的病毒性疾病，可通過空氣傳播，引起免疫抑制和繼發(fā)感染造成豬群的不穩(wěn)定， 給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。目前，弱毒疫苗能夠產(chǎn)生較好的細胞免疫，有效抵抗同源或相近的PRRSV 野毒感染，降低豬場發(fā)病率及穩(wěn)定控制豬場疫情。 在弱毒疫苗生產(chǎn)中，抗原收獲是決定疫苗質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。本試驗旨在通過對比PRRSV 抗原收獲時上清液與細胞液之間的病毒含量差異以及凍干后的病毒含量，篩選出較為優(yōu)勢的抗原收獲方式。

1 材 料

1.1 毒種 PRRSV（CH-1R 株），購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 細胞 Marc-145 細胞克隆株，兆豐華生物科技（福州）有限公司自主篩選。

1.3 試劑 MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶，購自Gibco 公司；胎牛血清，購自蘭州榮曄生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器設(shè)備 SAYO 二氧化碳培養(yǎng)箱、 倒置相差顯微鏡、GLZ-18 型凍干機、 漩渦型振蕩器、 轉(zhuǎn)瓶機等。

2 試驗方法

2.1 細胞制備 選擇處于對數(shù)生長期形成致密單層的Marc-145 細胞， 用0.25%胰酶-EDTA 溶液將細胞消化分散成細胞懸液， 按1:3 比例進行細胞分種， 用含胎牛血清和MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)。

2.2 細胞接毒 待細胞培養(yǎng)52 h 長成致密單層后，挑選細胞，將細胞分為 A、B、C、D、E 五組，每組2 瓶（每組中的2 瓶細胞必須由同一個母瓶傳出，分種率一樣，細胞長滿后肉眼看幾乎無差異）。 棄去細胞所有的培養(yǎng)液，將PRRSV（CH-1R 株）按1%接種量接種，補足MEM 維持液。 置溫室于37 ℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速為同一固定值。

2.3 抗原收獲

2.3.1 收獲時間 分5 個時間段收獲抗原。 A 組收獲時間較B 組提前4 h，B 組收獲時間為抗原含量最高的時間點 （依據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗獲得）；C 組收獲時間較 B 組往后 4 h；D 組收獲時間較 B 組往后 8 h，E組收獲時間較B 組往后12 h（見表1）。每組又分為-1 和-2， 例如 A-1 代表 A 組上清液，A-2 代表 A 組細胞液。

表1 分組與收獲時間

2.3.2 收獲上清液 A-1、B-1、C-1、D-1、E-1 這5 組細胞到達預(yù)定收獲時間后，輕輕搖晃細胞瓶，將病毒液分別收集到已滅菌的瓶中，取樣、測定樣品的病毒含量。

2.3.3 收獲細胞液 將 A-2、B-2、C-2、D-2、E-2 這5 組細胞在規(guī)定的時間內(nèi)收獲， 放入-20 ℃冷庫凍結(jié)， 第2 d 利用已經(jīng)結(jié)冰的病毒液將瓶壁的細胞刮下來，待病毒液全部融化后，連同細胞一起收獲，取樣、測定樣品的病毒含量。

2.3.4 凍干 將收獲的 A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、C-2、D-1、D-2、E-1、E-2 這 10 份樣品配苗，加入明膠蔗糖凍干保護劑進行真空冷凍干燥。 取凍干完成的樣品，測定樣品病毒含量。

2.4 病毒含量測定 用MEM 維持液將每個待檢樣品作 10 倍系列稀釋， 取 10-5、10-6、10-7、10-8四個梯度稀釋液接種單層的Marc-145 細胞， 置37 ℃培養(yǎng)5 d，按 Reed-Muench 法計算 TCID50[2]。

3 結(jié) 果

3.1 上清液與細胞液病毒含量差異 A、B、C、D、E五組，按不同的收獲方式分別收取上清液及細胞液，進行病毒含量測定，結(jié)果見表2。A 組和D 組上清液病毒含量略低于細胞液，B 組和E 組上清液病毒含量略高于細胞液，C 組上清液病毒含量與細胞液相同，通過分析上清液與細胞液病毒含量可知，兩種收獲方式獲得的病毒含量差異不顯著（P>0.05）。

表2 不同收獲方式的病毒含量差異情況

3.2 上清液與細胞液凍干后病毒含量差異 A、B、C、D、E 五組 10 份樣品凍干后，取樣，測病毒含量，結(jié)果見表3。 B、C、E 三組凍干后的上清液病毒含量略高于凍干后的細胞液，D 組凍干后的上清液病毒含量略低于凍干后的細胞液，A 組則相同。通過分析上清液與細胞液凍干后的病毒含量可知， 凍干后效價差異不顯著（P>0.05）。

表3 上清液與細胞液凍干后病毒含量差異

4 小結(jié)與討論

在試驗中， 為了證明上清液與細胞液之間的病毒含量差異不是在某一個點， 因此設(shè)計了病變具有代表性的5 個收獲時間點。從試驗結(jié)果來看，在收獲抗原時，無論是收獲上清液還是細胞液，它們之間的病毒含量差異并不顯著。 有文獻表明，PRRSV 的復制在胞漿中進行，在感染一定時間后，病毒粒子在細胞囊泡中成熟，并運輸?shù)綕{膜，通過細胞胞吐作用外排子代病毒[3]，所以，上清液中的病毒含量也是隨著病毒的繁殖規(guī)律相應(yīng)變化的。

雖然上清液與細胞液效價差異不顯著， 但是從它們的凍干制品還是可以看出上清液凍干后病毒含量總體會略高于細胞液， 可能是由于兩者的收獲方式不同造成的。 PRRSV 是一種有囊膜的病毒，在環(huán)境中不穩(wěn)定[2]。 只收獲上清液時，操作簡單、時間短、凍損少。收獲細胞液時，細胞內(nèi)的一些病毒在收獲時不是完全成熟的，而且收獲操作過程繁瑣、耗時長，增加了一次凍融，導致在凍干過程中耗損更大。這也是為什么細胞液的病毒含量不會每次都高于上清液的原因。

抗原只收獲上清液， 不需要經(jīng)過細胞凍融與刮苗這兩道工序，可以減少相應(yīng)的人力成本，減少冷庫的面積，提高細胞瓶的周轉(zhuǎn)頻率，減少抗原的耗損，提高生產(chǎn)效率，幾乎剔除了大部分細胞碎片，減少動物的臨床過敏反應(yīng)幾率。鑒于以上結(jié)果，筆者認為收獲上清液比收獲細胞液在抗原的生產(chǎn)中更具優(yōu)勢。