李小義，申曉東，張效平，楊 星，關(guān) 梅，王 雪

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所/貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心，貴陽 550025）

腸道微生物的組成對(duì)維持宿主生理和代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，同時(shí)與宿主神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能有直接關(guān)聯(lián)［1-4］。人類胃腸道中有1×103～1×104種微生物，是人體細(xì)胞數(shù)量的10 倍，因此，腸道微生物常被稱為遺忘的器官［5］。腸道微生物有外源和原生群體的區(qū)別，二者均與胃腸道消化相關(guān)，但外源微生物具有游離、暫時(shí)性的特征，原生微生物則是定植在消化道表面的核心群落，并對(duì)外來微生物在腸道表面定植有抵抗作用［6-8］。腸道微生物由真菌、酵母菌、病毒、細(xì)菌及古細(xì)菌等多種成員構(gòu)成，其中，細(xì)菌是組成腸道微生物的主要區(qū)系。鑒于腸道細(xì)菌對(duì)宿主健康的重要影響，近年來，腸道細(xì)菌的多樣性、功能及作用機(jī)制成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

魚類與其周圍環(huán)境及微生物具有獨(dú)特的緊密關(guān)系，可能是互惠的，也可能是有害的。因生活史、生態(tài)和環(huán)境因素的不同，魚類腸道細(xì)菌的組成在物種和個(gè)體之間有很大的差異。占主導(dǎo)地位的非洲慈鯛雄魚腸道微生物中益生菌豐度高，而從屬雄魚腸道微生物中病原菌豐度高，同時(shí)占主導(dǎo)地位的雄魚Alpha 多樣性也高于從屬雄魚，表明腸道細(xì)菌多樣性受群體地位影響［9］。鯉科（Cyprinidae）魚的4 個(gè)亞科魚類腸道微生物多樣性分析表明，同亞科的魚腸道菌群相似性較高，而不同亞科的魚腸道菌群差異較大［10］。喂食不同濃度殼聚糖，虹鱒魚（Oncorhynchusmykiss）腸道菌群多樣性、優(yōu)勢(shì)菌種類及虹鱒魚對(duì)嗜水氣單胞菌抗感染能力均有差異，表明虹鱒魚腸道菌受飼料成分的影響［11］。與健康卵形鯧鲹（pompano）腸道菌比較，患病魚腸道菌種類減少，疑似病原菌黑?；【鄬?duì)豐度由健康魚腸道中的17.19% 上升到 54.53%［12］。

稻田養(yǎng)魚在中國有著悠久的歷史，《魏武四時(shí)公制》中記載：“郫縣子魚黃鱗赤尾，出稻田，可以為醬”，表明早在1 700 年前的三國時(shí)代，中國就已經(jīng)有稻田養(yǎng)魚這一養(yǎng)殖模式。2011 年，貴州從江稻魚鴨系統(tǒng)入選全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)保護(hù)試點(diǎn)地。2013年，從江稻魚鴨系統(tǒng)入選第一批中國重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)。相較于池塘和其他水域環(huán)境，稻田養(yǎng)殖環(huán)境不穩(wěn)定，易受水稻栽培過程水體深度、溫度、水稻遮蔽、田內(nèi)食物種類和數(shù)量等的影響［13-15］。因此，稻田養(yǎng)殖鯉魚（Cyprinus carpio）與池塘養(yǎng)殖鯉魚腸道細(xì)菌種類、豐度均存在差異。本研究分別采集稻田養(yǎng)殖不同時(shí)間的從江田魚樣品，解剖取其腸道，對(duì)其腸道細(xì)菌的多樣性進(jìn)行測序分析，旨在了解稻田養(yǎng)殖鯉魚腸道細(xì)菌多樣性，為益生菌飼料開發(fā)研究、病原菌防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年 6 月、8 月和 11 月，分別從貴州省從江縣稻魚鴨養(yǎng)殖田采集田魚，每次15 尾。

1.2 田魚腸道取樣

迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，在超凈臺(tái)中對(duì)田魚進(jìn)行解剖取樣。用75%乙醇對(duì)田魚體表消毒后用解剖剪沿肛門朝前對(duì)魚進(jìn)行解剖。清理出腸道，用75%乙醇擦拭消化道外壁，取樣時(shí)清洗腸道內(nèi)容物，只取腸道，用無菌 PBS 緩沖液沖洗 3 次，每 5 尾 1 個(gè)組，每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)。6月采集的田魚為剛放入稻田1 d 的魚，樣品名稱編號(hào)為RS1；8 月采集的田魚在稻田中飼養(yǎng)了2 個(gè)月，樣品名稱編號(hào)為RS2；11 月采集的田魚在稻田中飼養(yǎng)了5個(gè)月，樣品名稱編號(hào)為RS3。

1.3 腸道微生物DNA 提取

采用CTAB 方法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，并將合格樣品干冰保存寄送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.4 16S rDNA 文庫構(gòu)建及多樣性分析

選 擇 細(xì) 菌 16S V4 區(qū)（515F：5′-GTGCCAGCM GCCGCG GTAA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），使用帶 Barcode 的特異引物為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，樣品純化后構(gòu)建文庫，使用HiSeq2500 PE250 上機(jī)測序。根據(jù)Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode 和引物序列后使用FLASH（V1.2.7）對(duì)每個(gè)樣本的reads 進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始 Tags 數(shù)據(jù)（Raw tags）；參照 Qiime（V1.9.1）的 Tags質(zhì)量控制流程，進(jìn)行Tags 截取、Tags 長度過濾等處理，得到的Tags 序列通過與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)檢測嵌合體序列，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）對(duì)所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為 OTUs（Operational taxonomic units），同時(shí)選取OTUs 的代表性序列。對(duì)OTUs 序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur 方法與SILVA132 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0），獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE（Version 3.8.31）軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs 代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對(duì)各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha 多樣性分析和Beta 多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S rRNA 基因測序結(jié)果分析

基于Illumina HiSeq 測序平臺(tái)測序，構(gòu)建PCR-free 文庫，然后進(jìn)行雙末端（Paired-End）測序。通過對(duì)Reads 進(jìn)行拼接，平均每個(gè)樣品測得88 800 條Tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到80 958 條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量為73 339，質(zhì)控有效率達(dá)82.59%。以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs，共得到3 699 個(gè) OTUs。其中 RS1、RS2 和 RS3 組分別獲得1 336、483、3 193 個(gè) OTUs。對(duì) OTUs 序列與 Silva132數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，注釋結(jié)果中，共有1 607（43.44%）個(gè)OTUs 注釋到屬水平。其他多樣性指數(shù)如表1 所示。3 個(gè)樣品組的覆蓋率均大于99.9%，表明本次檢測結(jié)果具有較好的覆蓋性。

表1 基于16S rRNA 基因序列的細(xì)菌多樣性指數(shù)

圖1 為蜜蜂群圖，圖1a 為所有樣本不同組別間物種總數(shù)的散點(diǎn)分布，即豐富度；圖1b 為Shannon 指數(shù)的比較，反映不同樣本間物種多樣性和均一性的差別。通過Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)測得的物種數(shù)在 RS2-RS3、RS1-RS2、RS1-RS3 兩兩組間具有顯著差異（P＜0.05），顯著性P分別為 0.000 3、0.010 4、0.010 4。Shannon 指數(shù)在 RS2-RS3、RS1-RS2 兩兩組間具有顯著差異（P＜0.05），顯著性P分別為0.019 0、0.025 4。Shannon 指數(shù)在RS1-RS3 2 組間不具有顯著差異（P＞0.05），P為0.827 6。結(jié)果表明，鯉魚在稻田里養(yǎng)殖的不同時(shí)間點(diǎn)，腸道微生物群落組成存在差異，RS1 組和RS3 組樣本微生物菌群多樣性高于RS2 組。

圖1 樣本組間多樣性差異

2.2 細(xì)菌多樣性分析

田鯉魚腸道微生物組成門水平分析結(jié)果如圖2所示。由圖2 可知，3 組樣品腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌門差異較大。RS1 組樣品中厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優(yōu)勢(shì)菌，所占豐度分別為33.43%、28.15%、22.94%和9.79%。RS2 組樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，所占豐度為94.05%，其次為厚壁菌門（2.58%）、梭桿菌門（Fusobacteria，2.05%）和放線菌門（Actinobacteria，0.68%）。RS3 組樣品中優(yōu)勢(shì)菌門為藍(lán)細(xì)菌（40.69%）、變形菌門（31.65%）、梭桿菌門（10.30%）和厚壁菌門（8.89%）。

圖2 樣本門水平上的物種相對(duì)豐度

屬水平分析（圖3），RS1 組和RS3 組樣品微生物種類較RS2 組豐富。RS2 組樣品相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌屬有2 種，其中，氣單胞菌屬（Aeromonas）相對(duì)豐度最高，為68.86%；其次是鯨桿菌屬（Cetobacterium，1.46%）。RS1 組微生物多樣性較高，相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌屬有9 種，依次為未分類的藍(lán)藻細(xì)菌（unidentifiedCyanobacteria，28.11%）、Romboutsia（13.33%）、未分類的梭菌屬（unidentifiedClostridiales，8.37%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，4.62%）、Paeniclostridium（2.34%）、葉桿菌屬（Phyllobacterium，2.15%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas，1.60%）、螺桿菌屬（Helicobacter，1.11%）、Turicibacter（1.07%）。RS3 組相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌有5 種，未分類的藍(lán)藻細(xì)菌相對(duì)豐度最高，為40.63%；其次是氣單胞菌屬（12.41%）、鯨桿菌屬（10.20%）、未分類的梭菌屬（2.07%）和鏈球菌屬（Streptococcus，1.44%）。

圖3 樣本屬水平上的物種相對(duì)豐度

3 討論

魚類腸道細(xì)菌研究可追溯至20 世紀(jì)上半葉。1927 年，Reed 等［16］對(duì) 34 尾黑線鱈魚［Melanogrammusaeglefinus（Linnaeus，1758）］的腸道菌進(jìn)行了培養(yǎng)分離，獲得的菌株主要包括變形桿菌、假單胞菌、無色桿菌、黃桿菌、芽孢桿菌等菌屬。最初，研究者認(rèn)為魚類腸道細(xì)菌主要來自周圍環(huán)境或者食物中，且細(xì)菌數(shù)量較少［17，18］。但這僅是基于可培養(yǎng)研究得出的結(jié)論，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)魚類腸道細(xì)菌的認(rèn)識(shí)逐漸增加。門水平分析，轉(zhuǎn)基因鯉魚腸道中厚壁菌門細(xì)菌較多，對(duì)照鯉魚腸道中擬桿菌門細(xì)菌較多［19］?；诳膳囵B(yǎng)菌和RT-PCR-DGGE分析，喂食含有β-葡聚糖的飼料組鯉魚腸道中腐敗希瓦氏菌和弧菌含量少于對(duì)照組，表明有益的飼料成分有助于防止病原微生物的入侵［20］。門水平分析，冷水性鯉魚腸道微生物以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主［21］。

本研究采集了稻田養(yǎng)殖不同時(shí)間點(diǎn)的田鯉魚，對(duì)其腸道細(xì)菌多樣性進(jìn)行了高通量測序研究，為了解不同養(yǎng)殖環(huán)境鯉魚腸道微生物組成提供了數(shù)據(jù)支持。門水平分析可知，稻田養(yǎng)殖不同時(shí)間點(diǎn)鯉魚腸道的主要優(yōu)勢(shì)菌種類和相對(duì)豐度均有差異，可能與不同養(yǎng)殖階段，稻田可食用餌料種類不同有關(guān)。RS3 組魚樣采集階段，水稻已收割，田魚主要以浮游藻類為餌料，所以田鯉魚腸道中，藍(lán)細(xì)菌相對(duì)豐度最高。屬水平分析可知，RS1 組田魚腸道優(yōu)勢(shì)菌屬較RS2 和RS3 組豐富，可能是受池塘和稻田養(yǎng)殖環(huán)境差異影響。