趙燕偉，王振興，王熙梓，賈曉東，李明君

(聊城市人民醫(yī)院,山東 聊城 252000)

食管癌是最常見、最具侵襲性的惡性腫瘤之一。每年全世界大約有40萬名新確診患者并且約有30萬患者死亡[1]。據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究院報(bào)道的數(shù)據(jù)顯示食管癌患者的五年生存率僅為19.9%。近年來食管癌的治療效果得到了很大改善，但食管癌的預(yù)后仍然不能令人滿意?；熀突诜暖煹闹委煼椒ㄒ褢?yīng)用于許多患者，根據(jù)目前醫(yī)學(xué)研究的統(tǒng)計(jì)分析，食管癌手術(shù)前的新輔助化療或聯(lián)合放化療的患者比單獨(dú)手術(shù)的患者的生存期會(huì)有所增加[2]。但是，對(duì)患者治療的方法是因人而異的，有些患者的化療效果很好，有些患者可能效果較差。所以確定哪些人適合使用哪種治療手段就顯得十分重要，患者也能避免嘗試不同無效的治療手段時(shí)帶來的副作用的傷害。所以，可以預(yù)測(cè)化療反應(yīng)的分子標(biāo)記物需要被更多的研究，找到適當(dāng)?shù)姆肿訕?biāo)記物，更好的識(shí)別哪些藥物對(duì)患者有效，哪些藥物患者會(huì)產(chǎn)生耐藥性，從而在克服潛在的化療耐藥性的情況下提供新的治療手段。

微小核糖核酸(miRNA)是一種非編碼RNA，和轉(zhuǎn)錄因子功能相似，可以調(diào)節(jié)信使RNA(mRNA)的表達(dá)，miRNA起到的是抑制基因表達(dá)的功能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)各種生物學(xué)功能的調(diào)控，目前很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA和轉(zhuǎn)錄因子在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用[3-4]。miRNA和轉(zhuǎn)錄因子作為生物標(biāo)記物的研究也很多，研究人員發(fā)現(xiàn)在食管癌患者和正常樣本中，多個(gè)miRNA表達(dá)異常，這些表達(dá)的差異直接影響了腫瘤的生長(zhǎng)、增值、侵襲，miR-485-5p就可以使乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶水平下降從而抑制食管癌的增殖和侵襲，miR-502通過促進(jìn)AKT磷酸化介導(dǎo)食管癌細(xì)胞增殖[5-6]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)還影響著化學(xué)療法的療效，miR-205納米制劑可以使得前列腺癌對(duì)化療敏感，miR-146a通過下調(diào)CHOP的表達(dá)誘導(dǎo)機(jī)體耐藥[7-9]。在多種癌癥的研究中有轉(zhuǎn)錄因子和miRNA作為標(biāo)志物的相關(guān)報(bào)道眾多，miR-590-3p通過抑制Wnt/beta-catenin通路內(nèi)的WIF1和DKK1基因促進(jìn)了結(jié)直腸癌的增殖，轉(zhuǎn)錄因子ZNF217是乳腺癌進(jìn)展過程中的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[10-12]，但是到目前為止miRNA是如何影響著食管癌對(duì)藥物的耐藥性的研究還很少。

本研究中我們整合識(shí)別了對(duì)不同藥物敏感及耐藥的細(xì)胞系，找到了在敏感和耐藥細(xì)胞系中起到關(guān)鍵作用的基因集合，之后我們整合了多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 及miRNA對(duì)靶基因調(diào)控關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建了包含轉(zhuǎn)錄因子及miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些調(diào)控關(guān)系是實(shí)驗(yàn)證實(shí)的，之后為了確定這些調(diào)控關(guān)系在食管癌中是被真正的激活，我們使用了食管癌患者的數(shù)據(jù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)每一對(duì)關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算，得到在食管癌中顯著相關(guān)的關(guān)系對(duì)，篩選后的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步進(jìn)行分析。使用不同藥物作用的下耐藥和敏感細(xì)胞系進(jìn)行差異分析得到的差異表達(dá)基因，篩選出藥物特異的調(diào)控模塊，從根本上找到那些影響細(xì)胞系耐藥相關(guān)的基因是被哪些轉(zhuǎn)錄因子或者miRNA調(diào)控的，這些轉(zhuǎn)錄因子及miRNA可能成為新的藥物耐藥性預(yù)測(cè)的標(biāo)記物，為后續(xù)的藥物研發(fā)及患者的治療提供幫助。

1 材料方法

1.1 敏感及耐藥細(xì)胞系識(shí)別

從癌癥藥物敏感性基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)獲(GDSC)[11]得了全部的食管癌細(xì)胞系表達(dá)數(shù)據(jù)及藥物作用后的IC50值數(shù)據(jù)。然后分別對(duì)每一種藥物治療的所有細(xì)胞系進(jìn)行劃分，分為敏感和耐藥細(xì)胞系。一個(gè)藥物作用于多個(gè)細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系的IC50值有所差異，通過計(jì)算同種藥物作用下不同細(xì)胞系IC50的均值及標(biāo)準(zhǔn)差，確定了分類標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞系的IC50值大于均值加上0.8倍的標(biāo)準(zhǔn)差為耐藥細(xì)胞系，IC50值小于均值減去0.8倍的標(biāo)準(zhǔn)差為敏感細(xì)胞系。為了保證后續(xù)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)準(zhǔn)確性，要求耐藥和敏感細(xì)胞系的數(shù)量均不小于5個(gè)，根據(jù)兩個(gè)測(cè)度識(shí)別了食管癌敏感及耐藥細(xì)胞系。

1.2 耐藥性顯著相關(guān)基因集合

通過識(shí)別得到的多組藥物相關(guān)的敏感和耐藥細(xì)胞系進(jìn)行差異表達(dá)計(jì)算，使用的方法為t檢驗(yàn)，選取顯著性結(jié)果的閾值為P< 0.01，得到每組藥物的耐藥性相關(guān)基因集合。對(duì)全部13種藥物的分類完成的細(xì)胞系進(jìn)行了相關(guān)計(jì)算，得到13組差異表達(dá)基因。

1.3 食管癌轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了識(shí)別出哪些miRNA和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控藥物耐藥及功能相關(guān)的基因，從多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)整理了實(shí)驗(yàn)證實(shí)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，miRNA調(diào)控靶基因的關(guān)系對(duì)來自miRTarBase[13]、TarBase[14]，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因及miRNA的調(diào)控關(guān)系來自于TRANSFAC[15]，還整合了單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)miRNA調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)TransmiR[16]，所有的調(diào)控關(guān)系都是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)的，初始的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)內(nèi)一共得到5 265條調(diào)控關(guān)系對(duì)，2 772個(gè)節(jié)點(diǎn)。

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了食管癌的mRNA和miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)[17]，首先對(duì)下載的數(shù)據(jù)的miRNA名稱注釋為成熟miRNA名稱，基因的ENSG名稱注釋成標(biāo)準(zhǔn)的基因縮寫名稱。使用得到的食管癌數(shù)據(jù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的每一對(duì)關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算，計(jì)算方法選擇的是皮爾森相關(guān)，相關(guān)閾值選取P< 0.05。進(jìn)行篩選后得到的網(wǎng)絡(luò)稱之為食管癌特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)內(nèi)剩余2 445對(duì)調(diào)控關(guān)系，1 612個(gè)節(jié)點(diǎn)。

1.4 耐藥相關(guān)模塊挖掘

為了得到各種藥物耐藥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊，將敏感和耐藥細(xì)胞系計(jì)算得到的差異表達(dá)基因投入網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)關(guān)聯(lián)有罪理論，以及盡可能的找到網(wǎng)絡(luò)內(nèi)調(diào)控種子基因的關(guān)鍵基因，本研究以差異基因作為種子基因，進(jìn)行擴(kuò)一步搜索其相關(guān)調(diào)控基因，獲取了藥物特異的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)并非為全聯(lián)通網(wǎng)絡(luò)，由多個(gè)分離的組分構(gòu)成，由于網(wǎng)絡(luò)內(nèi)節(jié)點(diǎn)度比較高的基因起到重要作用，這里選取模塊內(nèi)的最大組分，最大組分的模塊內(nèi)包含最核心的基因以及最相比其他組分最多的節(jié)點(diǎn)數(shù)量，包含更為豐富的信息，最后剔除其余散點(diǎn)，這一模塊稱為相關(guān)藥物的耐藥模塊。

1.5 功能富集分析及藥物作用相關(guān)通路檢驗(yàn)分析

功能富集分析使用的是在線的網(wǎng)站工具DAVID(Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)[5]，將模塊內(nèi)的miRNA剔除，使用模塊內(nèi)全部的轉(zhuǎn)錄因子及靶基因進(jìn)行富集分析，分析GO_BP功能及KEGG通路的富集結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 食管癌特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的miRNA及轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建了所有關(guān)系均為實(shí)驗(yàn)證實(shí)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)。因?yàn)楹芏嗷蛟诓煌M織內(nèi)是特異性表達(dá)的，所以想通過真實(shí)的食管癌數(shù)據(jù)對(duì)調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，下載了TCGA的173例食管癌患者腫瘤數(shù)據(jù)，對(duì)所有的調(diào)控關(guān)系對(duì)進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算，使用的方法為Pearson相關(guān)，經(jīng)過計(jì)算選取P值顯著的關(guān)系對(duì)作為食管癌中能行使特定調(diào)控功能的關(guān)系對(duì)，由這些關(guān)系所組成的網(wǎng)絡(luò)稱之為食管癌特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們可以基于這一網(wǎng)絡(luò)去探索網(wǎng)絡(luò)內(nèi)某個(gè)重要基因的調(diào)控關(guān)系，去進(jìn)一步研究該基因之所以能行駛功能是不是調(diào)控了其他基因?qū)е碌模蛘邚牧硪唤嵌日业皆摶虻谋磉_(dá)值改變的原因，是否是由于受其它基因的調(diào)控。構(gòu)建了這樣的食管癌特異的網(wǎng)絡(luò)對(duì)后續(xù)的關(guān)鍵調(diào)控子相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究提供了便利(見圖1)。

注：(a)中網(wǎng)絡(luò)內(nèi)橙色的點(diǎn)為miRNA，藍(lán)色的點(diǎn)為轉(zhuǎn)錄因子，綠色點(diǎn)為靶基因.

2.2 食管癌耐藥模塊

通過對(duì)藥物作用的食管癌細(xì)胞系進(jìn)行區(qū)分，將同一種藥物作用下不同耐藥能力的細(xì)胞系進(jìn)行區(qū)分，計(jì)算同種藥物作用下耐藥和敏感細(xì)胞系的差異表達(dá)基因，這些基因在藥物作用的時(shí)候使細(xì)胞系產(chǎn)生耐藥反應(yīng)，從而使得藥效降低。共篩選了滿足分析條件的食管癌藥物13種(見表1)。

表1 13種藥物中敏感耐藥細(xì)胞系數(shù)量Table 1 The number of sensitive resistant cell lines in 13 drugs

其中包含Trametinib、Topotecan、AZD7762和Afatinib等在內(nèi)的10種藥物均顯示已經(jīng)應(yīng)用于食管癌患者的治療[18-26]，其余3種藥物Teniposide、Dasatinib和Dactolisib也有研究發(fā)現(xiàn)其潛在的食管癌治療的價(jià)值，而且發(fā)現(xiàn)了不同患者使用該藥物時(shí)敏感性有一定差異[27-29]。對(duì)每一種藥物進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得了13組差異表達(dá)基因集合。我們發(fā)現(xiàn)在不同藥物的作用下，部分基因在兩組樣本中差異表達(dá)頻率很高，這些基因可能影響多種藥物在食管癌中的耐藥性。尤其是FANCD2OS、GUCY2F、HES7三個(gè)基因，分析得知其在不同的6種藥物中均顯著的差異表達(dá)，通過文獻(xiàn)查找也發(fā)現(xiàn)在以往的研究及試驗(yàn)中證實(shí)，這些基因發(fā)生突變和多個(gè)癌癥的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)，而且影響患者的預(yù)后[30-33]。繼續(xù)對(duì)這些耐藥相關(guān)的基因的研究，從而發(fā)現(xiàn)是否是因?yàn)檫@些耐藥相關(guān)基因發(fā)生了突變的患者預(yù)后較差的原因是否為對(duì)治療藥物產(chǎn)生了耐藥性導(dǎo)致的。

這些耐藥相關(guān)的基因是否受其他基因調(diào)控，或者是否依靠調(diào)控其他基因的表達(dá)從而真正實(shí)現(xiàn)患者耐藥性的產(chǎn)生，將差異表達(dá)基因映射到食管癌特異的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)內(nèi)，從網(wǎng)絡(luò)內(nèi)提取出和投入的種子基因最臨近的基因集合，將篩選后的最大聯(lián)調(diào)網(wǎng)絡(luò)提取出來，作為食管癌各種藥物特異的調(diào)控模塊，選擇網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的最大連通組分，既保留了網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控因子，也盡可能的保留了食管癌耐藥相關(guān)的差異表達(dá)基因，從而能繼續(xù)分析模塊的功能，以及提取每一步的調(diào)控關(guān)系，找到關(guān)鍵的調(diào)控因子。根據(jù)上文體積的方法，最終挖掘出13種食管癌耐藥模塊(見圖2)。

圖2 13種藥物耐藥特異模塊Fig.2 Resistance-related characteristic modules of 13 drugs

因?yàn)槊總€(gè)藥物耐藥基因不同，模塊的大小也有所差異。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)模塊內(nèi)，耐藥相關(guān)基因都位于模塊的下游，也就是這些耐藥相關(guān)基因的表達(dá)受到了一系列轉(zhuǎn)錄因子及miRNA的調(diào)控，上游的一個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控子發(fā)生改變，可能導(dǎo)致耐藥相關(guān)基因的異常表達(dá)的出現(xiàn)。

挖掘后的模塊進(jìn)行功能分析，分析每個(gè)模塊所行使的功能，我們使用是在線的功能注釋工具DAVID，通過分析結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，很多模塊的功能主要富集與細(xì)胞增殖及血管生成上，這些功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，有趣的是我們也發(fā)現(xiàn)了吉西他濱模塊內(nèi)的CRHBP和TP53均是細(xì)胞對(duì)藥物應(yīng)答功能相關(guān)基因[34]，該藥物相關(guān)模塊內(nèi)基因的富集結(jié)果(見圖3)。

圖3 吉西他濱模塊內(nèi)基因富集分析結(jié)果Fig.3 Results of gene enrichment analysis in Gemcitabine module

2.3 關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)λ幬锬退幮缘挠绊?/h3>

本研究對(duì)13種藥物進(jìn)行了具體的分析，研究發(fā)現(xiàn)所有的耐藥相關(guān)基因出現(xiàn)在模塊的下游，針對(duì)相應(yīng)的模塊進(jìn)行了詳細(xì)的分析，以拓?fù)涮婵的K為例(見圖4)。

圖4 拓?fù)涮婵邓幬锾禺惸KFig.4 Characteristic module of Topotecan

模塊內(nèi)黃色的點(diǎn)為差異表達(dá)的耐藥相關(guān)基因，再對(duì)這些差異表達(dá)基因研究中我們發(fā)現(xiàn)，以CSF1基因?yàn)榇淼哪K內(nèi)葉子節(jié)點(diǎn)上的基因，在很多研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它和藥物的耐藥性顯著相關(guān)[35]，而且其行使功能也是由于miR-130 miRNA家族基因調(diào)控的[36]，這與我們找到的模塊內(nèi)的調(diào)控關(guān)系是一致的。然后我們進(jìn)一步分析了網(wǎng)絡(luò)內(nèi)最上游的轉(zhuǎn)錄因子及miRNA，這一模塊內(nèi)最上游的基因?yàn)镾P1，其可以通過表達(dá)的改變調(diào)控相應(yīng)的通路使得腫瘤患者產(chǎn)生耐藥反應(yīng)，這樣的通路包括MAPK信號(hào)通路[37]，MAPK通路內(nèi)的RELA基因在模塊內(nèi)也是由SP1調(diào)控在進(jìn)一步調(diào)控其他耐藥相關(guān)基因。我們還發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)有兩個(gè)miRNA位于葉子節(jié)點(diǎn)上，hsa-miR-9-5p和hsa-miR-125a-5p這樣的位于葉子節(jié)點(diǎn)上的基因更可能直接行使功能，使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性。通過對(duì)最新的研究的檢索，發(fā)下hsa-miR-9-5p再轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中扮演者重要的角色，通過改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα致使相應(yīng)的細(xì)胞系產(chǎn)生耐藥性[38]。通過研究我們發(fā)現(xiàn)位于上游的基因可以通過一系列的調(diào)控關(guān)系，逐步的達(dá)到調(diào)控耐藥相關(guān)基因的目的，位于根節(jié)點(diǎn)的基因能直接的反應(yīng)出機(jī)體是否會(huì)產(chǎn)生耐藥性，但往往單一的某個(gè)基因的異常不足以準(zhǔn)確的確定機(jī)體是否產(chǎn)生耐藥。所以能通過節(jié)點(diǎn)調(diào)控一個(gè)或者多個(gè)耐藥相關(guān)的基因而且行使了重要功能的跟節(jié)點(diǎn)就顯得尤為關(guān)鍵，本研究認(rèn)為這些上游的基因可能成未來耐藥研究的新的生物標(biāo)記物。通過對(duì)模塊的分析，本研究挖掘了不同藥物模塊內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控基因，這些基因可能成為潛在的生物標(biāo)記物(見表2)。

表2 13種藥物模塊內(nèi)潛在關(guān)鍵調(diào)控子Table 2 Potential key regulators in 13 drug modules

3 討 論

藥物耐藥性是癌癥治療失敗的一個(gè)重要原因，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)了一些轉(zhuǎn)錄因子和miRNA可以影響藥物的耐藥性的產(chǎn)生，但這些研究大多是針對(duì)直接和耐藥相關(guān)的基因，對(duì)這些基因?yàn)槭裁幢磉_(dá)異常研究還有所欠缺，本文通過構(gòu)建了一個(gè)食管癌特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，基于這一網(wǎng)絡(luò)將可以調(diào)控耐藥基因的模塊都挖掘出來，得到13種作用于食管癌細(xì)胞系的耐藥模塊。而且隨著后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)了包括SP1及hsa-miR-21-5p、hsa-miR-1-5p在內(nèi)的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路上游關(guān)鍵調(diào)控子，這些調(diào)控子可能經(jīng)過一步或是幾步的調(diào)控最終改變耐藥基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致患者耐藥性的產(chǎn)生。各模塊內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控子可以作為潛在的生物標(biāo)志物，用于檢測(cè)病人是否適用相應(yīng)藥物。目前耐藥及敏感樣本的差異分析是根據(jù)不同的食管癌細(xì)胞系完成的，未來如果數(shù)據(jù)足夠充足，使用表達(dá)模式更復(fù)雜的不同癌癥亞型的樣本人群數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以進(jìn)一步提升分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前的研究分析的調(diào)控關(guān)系完全是來源于整理了實(shí)驗(yàn)證實(shí)關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，隨著研究的不斷進(jìn)展，以及潛在的調(diào)控關(guān)系可能還未被研究人員發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在使用的這些調(diào)控關(guān)系可能不夠完整，會(huì)遺漏部分真實(shí)存在的調(diào)控關(guān)系對(duì)，導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)的連通程度降低，選取網(wǎng)絡(luò)最大連通組分的時(shí)候會(huì)有部分真實(shí)的調(diào)控關(guān)系的遺漏，如果能很好的解決假陽(yáng)性率的問題，后續(xù)的研究中可以使用軟件預(yù)測(cè)的調(diào)控關(guān)系對(duì)來代替真實(shí)調(diào)控關(guān)系，將會(huì)大大增加轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的大小以及最終挖掘的知識(shí)更加豐富。