王建超，何銀鶯，劉鑫銘，沈朝貴，陳發(fā)興，郭林榕

(1福建省農(nóng)業(yè)科學院 果樹研究所，福建 福州 350013；2福建農(nóng)林大學 園藝學院，福建 福州 350002)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)為大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬(Phyllanthus)小喬木或灌木，其果實初食味酸澀，食后回味甘甜，故名余甘[1]。余甘子果實性微寒，具有健胃、消食、潤肺、生津、收斂止瀉、清熱降火、解毒、下氣除痰、消滯止咳，解除疲勞等功效[2]。全世界約有17個國家的傳統(tǒng)藥物體系中使用余甘子，我國約有16個民族使用該藥，歷版《中華人民共和國藥典》均有收錄[3]，同時該樹種是聯(lián)合國推薦種植的3種保健樹種之一[4]。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，余甘子果實中含有大量的超氧化歧化酶(SOD)、鞣質(zhì)、抗壞血酸、有機酸、黃酮和多糖等物質(zhì)，具有抗微生物感染、抗腫瘤、抗衰老、抗突變、降血脂和降血壓等功效[5-9]，研究余甘子果實品質(zhì)多樣性，對于余甘子功能產(chǎn)品開發(fā)和種質(zhì)資源創(chuàng)新利用有重要意義。

我國余甘子種質(zhì)資源主要分布于福建、廣東、廣西、云南、海南、貴州、四川、臺灣等省份的熱帶亞熱帶地區(qū)[3]。目前，余甘子良種栽培主要集中在廣東、福建兩省，其中福建除擁有豐富的余甘子野生資源外，人工種植面積也最大[10]。福建省漳州市與廣東省潮州市是兩省的交界地區(qū)，兩地余甘子良種栽培歷史悠久，選育的栽培品種(系)眾多，因此綜合分析與評價該地區(qū)不同栽培種的余甘子果實品質(zhì)，對于余甘子新品種選育和種質(zhì)資源利用有重要意義。目前余甘子果實的品質(zhì)分析評價研究主要集中在維生素、微量元素、揮發(fā)油、酚酸等方面[11-15]，尚未見關(guān)于余甘子果實有機酸的研究報道。為此，本研究以福建漳州與廣東潮州兩地的16份余甘子種質(zhì)資源果實為試材，從基本品質(zhì)指標與有機酸含量等方面，分析余甘子種質(zhì)資源果實品質(zhì)的遺傳多樣性，利用主成分分析和聚類分析等方法，系統(tǒng)分析與評價兩省交界地區(qū)余甘子果實的品質(zhì)差異，以期為余甘子種質(zhì)資源創(chuàng)新利用與選種育種提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年10-11月，在位于福建省福州市晉安區(qū)新店鎮(zhèn) (119°19′59″E，26°07′48″N，海拔20 m)的國家熱帶植物種質(zhì)資源庫-余甘子種質(zhì)資源分庫中，選擇成熟度一致、無病蟲害且無機械損傷的16份余甘子種質(zhì)資源的成熟果實作為試驗材料。其中源自福建漳州的種質(zhì)資源有柴甘、甜甘、玻璃種、玻璃甘、正甜、獅頭、土餅、土尖、肉甘、詔安土種1和詔安土種2；源自廣東揭陽的種質(zhì)資源有揭西種、南帶甘、甜種、餅甘接和尖屁股。每品種選3株樹，每株采摘50個成熟果實，共計150個，隨機分為3組，每組50個，去核，果肉液氮冷凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 測定指標與方法

用電子天平(精度0.01 g)測定單果質(zhì)量，用電子數(shù)顯游標卡尺測定縱徑和橫徑，通過二者比值計算果形指數(shù)；還原糖含量測定用直接滴定法 (GB 5009.7―2016)；蔗糖含量測定用酸水解-萊因-埃農(nóng)氏法(GB 5009.8―2016)，總糖含量=還原糖含量+蔗糖含量/0.95；水分含量測定用直接干燥法(GB 5009.3―2016)；總酸含量測定用酸堿滴定法(GB/T 12456―2008)；糖酸比=總糖/總酸；蛋白質(zhì)含量測定用凱氏定氮法(GB 5009.5―2016)；脂肪含量測定用索氏抽提法(GB 5009.6―2016)；有機酸及抗壞血酸含量測定用高效液相色譜法(HPLC)(GB 5009.157―2016)，其中，色譜條件：Atlanis T3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相是pH 2.2的0.02 mol/L NaH2PO4緩沖溶液(A)和甲醇溶液(B)，梯度洗脫(0 min 0% B，8 min 15% B，17 min 30% B，26 min 0% B)，柱溫 25 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Microsoft Excel 2003處理數(shù)據(jù)；對于變異系數(shù)大于10%的品質(zhì)指標，首先用SPSS 22.0進行標準化轉(zhuǎn)化，然后進行主成分分析和聚類分析，其中聚類分析方法采用離差平方和法(Ward法)，組間距離采用平方歐氏距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 16份余甘子種質(zhì)資源果實的外觀品質(zhì)

16份余甘子種質(zhì)資源果實的外觀品質(zhì)見表1。

表1表明，16份余甘子種質(zhì)資源果實單果質(zhì)量平均為7.57 g，變異系數(shù)25.83%；以土餅單果質(zhì)量最高，為12.17 g，與其他品種存在顯著差異；柴甘單果質(zhì)量最低，為5.48 g。果實縱徑為18.20～23.56 mm，平均為20.32 mm，其中玻璃種縱徑最小，土餅最大，變異系數(shù)為7.12%。果實橫徑為21.44～28.87 mm，平均為24.09 mm，柴甘橫徑最小，土餅最大，變異系數(shù)為9.64%。果實果形指數(shù)為78.43%～88.58%，平均為84.60%，獅頭果形指數(shù)最小，甜甘最大，變異系數(shù)為3.85%，果實為扁圓形或近圓形。

2.2 16份余甘子種質(zhì)資源果實的基本營養(yǎng)物質(zhì)含量

16份余甘子種質(zhì)資源果實的基本營養(yǎng)物質(zhì)含量見表2。

表2 16份余甘子種質(zhì)資源果實的基本營養(yǎng)物質(zhì)含量Table 2 Basic nutrition quality indexes of 16 germplasm resources of Phyllanthus emblica

由表2可知，16份余甘子種質(zhì)資源的蛋白質(zhì)含量為0.31～0.69 g/hg，平均為0.50 g/hg，甜甘最小，玻璃甘最大。果實水分含量均比較高，差異較小，變異系數(shù)僅為1.23%，其中水分含量較大的品種為揭西種、土尖、詔安土種2、甜種和甜甘，均在90 g/hg以上。16份余甘子種質(zhì)資源的脂肪含量較低，為0.042～0.181 g/hg，變異系數(shù)為45.78%，差異較大，揭西種最高，與其他品種差異顯著。16份余甘子種質(zhì)資源的糖酸含量均有明顯差異，蔗糖含量為0.127～0.650 g/hg，其中南帶甘最小，詔安土種1最高，二者相差近5倍，整體變異系數(shù)為54.49%；還原糖含量為3.72～6.37 g/hg，總糖含量為3.93～6.73 g/hg，總糖含量較高的品種有詔安土種1、獅頭和尖屁股。余甘子果實總酸含量為11.16～18.27 g/kg，含量較高的有玻璃種、柴甘、土餅、餅甘接和詔安土種1。余甘子果實糖酸比為2.21%～4.81%，變異系數(shù)為21.40%，不同品種糖酸比差異明顯，且糖酸比較低會影響余甘子鮮食口感。

2.3 16份余甘子種質(zhì)資源果實的有機酸及抗壞血酸含量

由表3可以看出，用HPLC法從16份余甘子種質(zhì)果實樣品中檢測到7種有機酸，分別為草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和富馬酸，其中乙酸含量最高，有機酸平均含量從大到小依次為乙酸>乳酸>檸檬酸>草酸>蘋果酸>酒石酸>富馬酸。

表3 16份余甘子種質(zhì)資源果實的有機酸與抗壞血酸含量Table 3 Organic acid and ascorbic acid contents of 16 germplasm resources of Phyllanthus emblica

由表3可知，在16份余甘子種質(zhì)資源中，草酸含量最高的是詔安土種2，為16.87 mg/hg；獅頭草酸含量最低，為10.60 mg/hg。酒石酸與富馬酸在余甘子果實中較少，酒石酸含量為0.48～1.80 mg/hg，富馬酸為0.36～1.41 mg/hg，2種有機酸組分在不同種質(zhì)間差異巨大，變異系數(shù)分別為35.87%和39.39%。蘋果酸含量為2.86～10.98 mg/hg，其中土餅與南帶甘2份種質(zhì)相差4倍以上。16份余甘子資源的抗壞血酸含量為167.11～407.76 mg/hg，平均為248.94 mg/hg，變異系數(shù)為26.83%，其中餅甘接和土尖含量均較低，詔安土種1果實中的抗壞血酸含量顯著高于其他品種，含量為407.76 mg/hg。乳酸、乙酸和檸檬酸3種組分含量占有機酸總量的90%以上，其中乳酸含量平均為166.60 mg/hg，以正甜含量最高，為380.82 mg/hg，與其他品種差異顯著。乳酸含量變異系數(shù)達62.25%，為所測品質(zhì)指標中最大。乙酸平均含量為194.68 mg/hg，含量最大的為詔安土種1，為375.72 mg/hg，與其他品種差異顯著；含量最低的為土尖，為108.05 mg/hg。檸檬酸是成熟果實中的主要有機酸之一，16份余甘子果實中檸檬酸含量為15.26～65.61 mg/hg，含量較高的品種為詔安土種2、獅頭和詔安土種1，含量最低的品種為甜種，與其他品種差異顯著。16份余甘子總有機酸含量為232.71～668.73 mg/hg，平均為424.04 mg/hg，占總酸比例為29.59%，其中正甜總有機酸含量最高，占總酸比例為48.84%；餅甘接總有機酸含量最低。16份余甘子種質(zhì)資源的有機酸占總酸比例差異明顯，變異系數(shù)為16.57%。

2.4 余甘子果實品質(zhì)指標的相關(guān)性分析

表4表明，16份余甘子種質(zhì)資源果實的水分含量與還原糖、總糖、抗壞血酸、乳酸、富馬酸含量呈極顯著負相關(guān)，與乙酸含量呈顯著負相關(guān)，與草酸含量極顯著正相關(guān)；蛋白質(zhì)含量與乳酸含量存在極顯著負相關(guān)；蔗糖含量與總糖含量呈極顯著正相關(guān)，與還原糖、乙酸、富馬酸含量呈顯著正相關(guān)；草酸含量與總糖、還原糖、乳酸含量呈顯著或極顯著負相關(guān)；抗壞血酸含量與乳酸、乙酸、富馬酸含量呈極顯著正相關(guān)，表明余甘子果實的抗壞血酸含量與有機酸相關(guān)組分關(guān)系密切；富馬酸含量與乙酸含量呈極顯著正相關(guān)。

表4 余甘子果實品質(zhì)指標的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of fruit quality indicators of Phyllanthus emblica

2.5 余甘子果實品質(zhì)指標的主成分分析

主成分分析可將原來多個變量轉(zhuǎn)化成為少數(shù)幾個不相關(guān)的主成分，并保證原始數(shù)據(jù)信息最大限度地保留[16]，特征值表示對應(yīng)主成分能夠描述原有信息的多少[17]。余甘子果實品質(zhì)指標主成分的方差貢獻率見表5。

表5 余甘子果實品質(zhì)指標主成分的方差貢獻率Table 5 Variance contribution rates of principal components to quality characteristics of Phyllanthus emblica

從表5可見，前5個主成分的特征值均大于1，累積方差貢獻率為82.249%，因此提取前5個主成分代替原品質(zhì)指標分析評價余甘子果實品質(zhì)，達到降維目的。根據(jù)主成分載荷矩陣(表6)結(jié)果可知，第1主成分中載荷較高的指標有還原糖、總糖、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸和總有機酸含量等，說明這些指標對第1主成分產(chǎn)生正向影響；第1主成分越大時，抗壞血酸、有機酸類、糖類等品質(zhì)指標也越大，因有機酸和糖類是影響果實口感的重要因素，因此將第1主成分命名為口感因子。第2主成分中蛋白質(zhì)載荷權(quán)數(shù)最高為0.766，因此將第2主成分命名為蛋白質(zhì)因子。第4主成分中總酸載荷較高，為0.732，命名為酸度因子。草酸和蘋果酸含量對第3主成分產(chǎn)生正向影響。第5主成分中酒石酸載荷為-0.598，產(chǎn)生負向影響，因草酸、酒石酸和蘋果酸是果實產(chǎn)生酸味的重要因素，因此將第3主成分和第5主成分分別命名為酸味因子1和酸味因子2。

表6 余甘子果實品質(zhì)指標的主成分載荷矩陣Table 6 Loading matrix of 5 principal components of Phyllanthus emblica

用各指標變量的主成分載荷(表6)除以主成分相對應(yīng)的特征值開平方根(表5)，得到 5個主成分中每個指標所對應(yīng)的系數(shù)，即特征向量[18]，以特征向量為權(quán)重構(gòu)建5個主成分的表達函數(shù)式，以各個主成分對應(yīng)的方差貢獻率作為權(quán)重，由主成分得分和對應(yīng)的權(quán)重線性加權(quán)求和得到綜合評價函數(shù)為：

F=0.414 25Z1′+0.132 08Z2′+0.106 39Z3′+0.094 97Z4′+0.074 8Z5′。

式中：F為綜合評價得分，Z1′、Z2′、Z3′、Z4′、Z5′分別為第1至第5主成分的得分。

根據(jù)綜合評價模型，計算出16份余甘子種質(zhì)資源果實品質(zhì)的綜合評價得分和排序結(jié)果見表7。

表7 16份余甘子種質(zhì)資源綜合評價得分(F)和排名Table 7 Scores and rankings of principal components from 16 germplasm resources of Phyllanthus emblica

由表7可見，在5種主成分評價體系下，可以較為直觀地揭示余甘子果實品質(zhì)性狀的優(yōu)劣情況。綜合評價得分排在前5位的余甘子種質(zhì)資源為詔安土種1、柴甘、正甜、獅頭和尖屁股。以第1主成分與第2主成分得分建立直角坐標系(圖 1)，可將16份種質(zhì)分為兩類，第1類為柴甘、甜甘、正甜、獅頭、詔安土種1和尖屁股，均為綜合評價得分較高品種；其余種質(zhì)分為另一類。

1.柴甘；2.甜甘；3.玻璃種；4.玻璃甘；5.正甜；6.獅頭；7.土餅；8.土尖；9.肉甘；10.詔安土種1；11.詔安土種2；12.揭西種；13.南帶甘；14.甜種；15.餅甘接；16.尖屁股1.Chaigan;2.Tiangan;3.Bolizhong;4.Boligan;5.Zhengtian;6.Shitou;7.Tubing;8.Tujian;9.Rougan;10.Zhaoantuzhong 1;11.Zhaoantuzhong 2;12.Jiexizhong;13.Nandaigan;14.Tianzhong;15.Bingganjie;16.Jianpigu圖1 16份余甘子種質(zhì)資源的主成分1和2得分Fig.1 PCA scores for 16 germplasm resources of Phyllanthus emblica on PC1 and PC2

2.6 16份余甘子種質(zhì)資源的系統(tǒng)聚類分析

聚類分析結(jié)果(圖2)顯示，正甜、獅頭、柴甘與尖屁股平方歐氏距離=15時聚在一起，后在平方歐氏距離=20時與詔安土種1聚為一類；該研究結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本一致，綜合評價得分較高品種聚為一類，也進一步驗證了綜合評價模型的有效性。平方歐氏距離=20時，16份余甘子種質(zhì)資源分為2類：第1類聚集了5份種質(zhì)，分別為正甜、獅頭、柴甘、尖屁股、詔安土種1；其中正甜、獅頭、柴甘、詔安土種1為福建本地種，尖屁股為廣東品種，表明相同地域的品種營養(yǎng)成分相近或品質(zhì)相當，有一定的地域特點。第2類聚集了玻璃種、土餅、甜甘、南帶甘、土尖、甜種、餅甘接、肉甘、詔安土種2、玻璃甘、揭西種；其中南帶甘、揭西種、甜種、餅甘接4份種質(zhì)均為廣東地區(qū)品種，其余為福建品種，表明地理位置相近區(qū)域存在較頻繁的種質(zhì)遺傳交叉，可以通過種質(zhì)交流和品種選育篩選品質(zhì)較好的栽培種加以推廣。

通過對平方歐氏距離=20時的2類種質(zhì)不同品質(zhì)指標平均值進行分析(表8)發(fā)現(xiàn)，第1類種質(zhì)的糖類、抗壞血酸及乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸含量均較高。

表8 不同聚類類別余甘子果實品質(zhì)的比較Table 8 Comparison of quality indexes of different Phyllanthus emblica types

3 討論與結(jié)論

目前，研究者對臍橙[19]、梨[20]、桃[21]、蘋果[22]、荔枝[23]、枇杷[24]、菠蘿[25]、芒果[26]、菠蘿蜜[27]和葡萄[28]等果實中的有機酸種類和含量進行了分析評價，根據(jù)積累主要有機酸的不同可將植物果實分為3大類，即蘋果酸型、檸檬酸型和酒石酸型[29]。多數(shù)植物果實中含有較多酒石酸、蘋果酸、檸檬酸，根據(jù)本研究結(jié)果，余甘子果實內(nèi)含量較高的有機酸為乙酸、乳酸和檸檬酸。猜測原因可能為，余甘子最初是由中草藥發(fā)展為保健果樹的，其果實風味獨特；此外，余甘子掛樹期較長且落果率低[30]，生產(chǎn)上可采摘至2月份，成熟期往往以果實表形判斷，因此余甘子果實成熟后掛樹期間有機酸可能發(fā)生了降解與轉(zhuǎn)化。研究表明，有機酸可在果實成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環(huán)等呼吸作用基質(zhì)或糖原異生作用的基質(zhì)而被消耗[29]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)[31]、烏頭羧酸酶(ACO)[32]、蘋果酸酶(ME)等是影響有機酸代謝的重要酶，其中ACO 可促使檸檬酸降解，從而導致成熟果實有機酸水平下降[33]；ME活性升高，可以促進蘋果酸的降解和轉(zhuǎn)化[34]。因此，以余甘子果實發(fā)育為基礎(chǔ)，研究余甘子果實的有機酸積累與代謝機制，有助于揭示果實有機酸代謝調(diào)控和提升果實品質(zhì)。

1～16代表的余甘子種質(zhì)資源，與圖1相同1-16.Phyllanthus emblica germplasm resources with same order in Fig.1圖2 16份余甘子種質(zhì)資源系統(tǒng)的聚類分析結(jié)果Fig.2 Dendrogram obtained from cluster analysis of Phyllanthus emblica fruit quality in 16 germplasm resources

余甘子果實中抗壞血酸豐富且穩(wěn)定，在高溫下能夠較長時間保持穩(wěn)定[35]且擁有多種生理功能，適宜作為食品加工及保健品原材料加以開發(fā)利用[36]。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，余甘子中抗壞血酸含量與乳酸、乙酸、富馬酸含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.713，0.879和0.950，表明余甘子果實的抗壞血酸含量與有機酸相關(guān)組分關(guān)系密切。已有研究表明，抗壞血酸及其氧化態(tài)脫氫抗壞血酸可與部分有機酸相互轉(zhuǎn)化[37]，表明抗壞血酸代謝相關(guān)機制與有機酸密不可分。

本研究通過評價模型對16份余甘子種質(zhì)的綜合評價表明，得分排名前10的種質(zhì)中有 8 份來自福建省，表明以糖酸指標評價時，福建省余甘子果實品質(zhì)占優(yōu)，這是因為福建地區(qū)栽培歷史悠久，野生馴化的栽培品種較多，其有機酸等品質(zhì)較廣東品種更優(yōu)，風味更為獨特，且與廣東種質(zhì)相比福建種質(zhì)口感多為偏酸類型。

綜上所述，不同品種(系)余甘子種質(zhì)資源果實品質(zhì)表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，從16份余甘子種質(zhì)資源果實中檢測到7種有機酸，其中乙酸、乳酸和檸檬酸含量較高；用主成分分析方法建立的綜合評價模型發(fā)現(xiàn)，16份種質(zhì)資源中詔安土種1、柴甘、正甜、獅頭、尖屁股等品種(系)的綜合評價得分較高；主成分評分較高的種質(zhì)資源含有較多的抗壞血酸和有機酸等物質(zhì)，適宜作為功能食品加工原材料加以開發(fā)利用。