王芳，王露月，付少偉，者湘漪,，李洪濤，李冬妹，潘澤民*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室，新疆 石河子 832002)

宮頸癌是女性婦科惡性腫瘤之一[1-2]，2018年全球新增宮頸癌病例約57萬例，死亡31萬例[3]。宮頸癌在我國的發(fā)病率和病死率逐漸增加，且逐漸年輕化[4-5]。人乳頭瘤病毒 (human papilloma virus,HPV) 感染是宮頸癌發(fā)生的常見原因[6-7]，大部分宮頸癌是由持續(xù)性感染高危型HPV所引起的[8-9]。宮頸癌惡性程度高，轉(zhuǎn)移和侵襲能力強，早期常無明顯癥狀和體征，容易漏診和誤診[10]。

TCP11基因是編碼受精促進肽受體(FPP)小鼠TCP11基因的人類同源物[11]，定位于人染色體6p21[12]。TCP11基因在睪丸編碼TCP11a，TCP11b和TCP11c 3個異構(gòu)體[11]。有文獻報道，子宮癌肉瘤(Uterine Carcinosarcoma，UCS)同時顯示癌性和肉瘤性成分，TCP11基因的 DNA甲基化變化是其肉瘤成分的特征[13]。TCP11基因在宮頸癌中的研究尚未有文獻報道。因此，本研究的目的是探討TCP11基因在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達情況、與患者預(yù)后和HPV感染的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

HaCaT、C33A細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，HeLa、SiHa細(xì)胞購自武漢博士德生物工程有限公司。主要試劑見表1。

表1 主要試劑及購買公司

1.2 數(shù)據(jù)來源

1.2.1 The Human Protein Atlas(HPA)數(shù)據(jù)庫

HPA數(shù)據(jù)庫是人類蛋白質(zhì)表達圖數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)，從RNA和蛋白水平研究人類不同組織和器官中的蛋白表達情況的數(shù)據(jù)庫[14]。本文利用HPA數(shù)據(jù)庫分析TCP11蛋白表達高低與宮頸癌患者生存率的相關(guān)性。

1.2.2 Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)數(shù)據(jù)庫

GEPIA數(shù)據(jù)庫 (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)，是由北京大學(xué)團隊研究開發(fā)，利用來自TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的9 736個腫瘤和8 587個正常樣品進行基因表達分析的數(shù)據(jù)庫[15]。本文利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析TCP11基因在宮頸癌的表達及與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.2.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫

UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/)主要用于對癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)項目中大量的基因數(shù)據(jù)進行深入分析[16]。本文利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析TCP11基因在宮頸癌的表達、與患者預(yù)后的關(guān)系及其啟動子甲基化狀態(tài)。

1.3 樣本收集

收集新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2017～2019年就醫(yī)患者組織蠟塊及其HE切片，其中正常宮頸組織31例、宮頸癌組織35例。收集患者病史資料和HC-2檢測HPV感染的結(jié)果。樣本的收集已得到石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)及患者本人知情并簽署知情同意書。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

永生化的上皮細(xì)胞HaCaT、宮頸癌SiHa、HeLa、C33A細(xì)胞培養(yǎng)在含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基均為含F(xiàn)BS、1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，其中HaCaT細(xì)胞是含15% FBS、宮頸癌細(xì)胞是含10% FBS。間隔2～3 d傳代。

1.5 方法

1.5.1 組織芯片實驗

根據(jù)收集的正常宮頸組織及宮頸癌組織蠟塊的HE切片，由病理科專家標(biāo)記切片上正常宮頸上皮及宮頸癌上皮的部位，按照記號在組織蠟塊上標(biāo)記。在供體蠟塊上打孔取樣，再點樣在受體蠟塊上，從而制成組織芯片。芯片采用EnVision二步法染色，TCP11抗體稀釋為1∶200，結(jié)果由病理學(xué)專家閱片判讀。

1.5.2 Western blot實驗

取對數(shù)生長期HaCaT、SiHa、HeLa、C33A細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。運用SDS-PAGE電泳80 V 30 min，110 V 60 min，電轉(zhuǎn)110v 60 min，封閉液(5%脫脂奶粉)封閉2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12～14 h，洗去一抗，二抗(兔抗1∶5 000)室溫孵育2 h，洗去二抗，化學(xué)發(fā)光儀曝光。

1.5.3 實時熒光定量PCR實驗，

取對數(shù)生長期HaCaT、SiHa、HeLa、C33A細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。每組RNA取1ug逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參，擴增條件為90 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s,60 ℃30 s,40個循環(huán)。運用2-ΔΔCt法計算TCP11基因 mRNA相對表達量。引物序列如表2所示。

表2 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌組織中TCP11基因mRNA表達水平

運用UALCAN、GEPIA數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌組織中TCP11基因mRNA表達水平，結(jié)果顯示UACLAN數(shù)據(jù)庫中TCP11基因mRNA表達量的中位數(shù)在正常宮頸以及宮頸癌組織分別是0.171、2.373 每百萬轉(zhuǎn)錄本(Transcript per million,TPM)，P<1E-12，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1A)。在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，宮頸癌組織中TCP11基因 mRNA表達高于正常宮頸組織(圖1B)。

圖1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測TCP11基因在宮頸癌組織中的mRNA表達(T:Tumor;N:Normal;*:P<0.05)

2.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析TCP11基因啟動子甲基化狀態(tài)

運用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌中TCP11基因啟動子甲基化的狀態(tài)，結(jié)果顯示宮頸癌組織中TCP11基因啟動子甲基化低于正常宮頸組織，P=7.37E-07，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測TCP11基因表達與宮頸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析TCP11基因的表達與宮頸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，在宮頸癌患者21～40、41～60、61～80的年齡段TCP11基因的表達有差異(P<0.05)，在81～100的年齡段TCP11基因的表達無差異，而TCP11基因在宮頸癌患者的各年齡段之間的表達水平無差異(P>0.05)，見圖3A。此外，TCP11基因在宮頸癌不同病理分級的表達均無差異(P>0.05)，見圖3B。

Bata value:DNA甲基化水平圖2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測宮頸癌組織中TCP11基因啟動子甲基化水平

2.4 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測TCP11基因表達與宮頸癌患者生存率的關(guān)系

運用UALCAN、GEPIA、HPA數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析TCP11基因表達水平與宮頸癌患者生存率的關(guān)系，其中UACLAN數(shù)據(jù)庫有291例(TCP11高表達76例，TCP11低表達215例)宮頸癌患者、GEPIA數(shù)據(jù)庫有292例(TCP11高表達146例，TCP11低表達146例)宮頸癌患者、HPA數(shù)據(jù)庫有291例(TCP11高表達123例，TCP11低表達168例)宮頸癌患者。結(jié)果均顯示，TCP11低表達與宮頸癌患者不良預(yù)后有關(guān)，而TCP11高表達反而對宮頸癌患者預(yù)后有利(圖4)。

A：TCP11基因在正常及宮頸癌患者各年齡段(21-40、41-60、61-80、81-100)的相對表達水平比較；B：TCP11基因在正常及宮頸癌不同病理分級的相對表達的比較圖3 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測TCP11基因表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

A：UACLAN數(shù)據(jù)庫分析TCP11基因的表達與患者生存率的關(guān)系；B：GEPIA數(shù)據(jù)庫分析TCP11基因的表達與患者生存率的關(guān)系；C：HPA數(shù)據(jù)庫分析TCP11基因的表達與患者生存率的關(guān)系圖4 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測TCP11基因表達與宮頸癌患者生存率的關(guān)系

2.5 TCP11基因在宮頸癌組織中高表達

運用組織芯片檢測在正常宮頸(31例)及宮頸癌(35例)組織中TCP11基因表達水平。結(jié)果顯示，與正常宮頸組織比較，TCP11基因在宮頸癌組織中高表達(圖5、表3)。

圖5 TCP11基因在正常宮頸及宮頸癌組織的表達

表3 TCP11基因免疫組化染色結(jié)果統(tǒng)計表

2.6 TCP11基因的表達與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系

分析所收集宮頸癌組織樣本的臨床特征與TCP11基因表達之間的關(guān)系，結(jié)果顯示TCP11基因表達可能與年齡及分化程度無關(guān)(P>0.05)，見表4。

表4 TCP11基因的表達與臨床特征的關(guān)系

2.7 TCP11基因與HPV感染的關(guān)系

對所收集正常宮頸及宮頸癌組織樣本的HC-2檢測結(jié)果進行分析，結(jié)果顯示TCP11基因的表達可能不受HPV感染的影響(P>0.05)，見表5。

表5 正常宮頸及宮頸癌組織中TCP11基因與HPV感染的關(guān)系

2.8 宮頸癌細(xì)胞TCP11蛋白質(zhì)表達水平

Western blot實驗表明，與永生化的上皮細(xì)胞HaCaT相比，TCP11蛋白質(zhì)在宮頸癌SiHa、HeLa、C33A細(xì)胞中高表達(圖6)。

圖6 TCP11蛋白在永生化的上皮細(xì)胞(HaCaT)及宮頸癌細(xì)胞(SiHa、HeLa、C33A)的表達水平

2.9 宮頸癌細(xì)胞TCP11基因 mRNA表達水平

實時熒光定量PCR實驗檢測TCP11基因mRNA在永生化的上皮細(xì)胞HaCaT以及宮頸癌SiHa、HeLa、C33A細(xì)胞中的表達，結(jié)果表明宮頸癌細(xì)胞中TCP11基因mRNA表達水平明顯高于永生化的上皮細(xì)胞HaCaT(圖7)。

**：P<0.01;***：P<0.001;****：P<0.0001圖7 TCP11基因在永生化的上皮細(xì)胞(HaCaT)及宮頸癌細(xì)胞(SiHa、HeLa、C33A)mRNA的表達水平

3 討論

在女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率和病死率位于第2位[17-18]。雖然宮頸癌的診斷和治療策略有所改善，但是宮頸癌病死率依然很高，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是宮頸癌治療的重要障礙[19]。目前，TCP11基因與腫瘤相關(guān)的研究文獻較少，并且TCP11基因在宮頸癌中的作用也尚不清楚。

TCP11基因是一種睪丸特異性基因產(chǎn)物[11]。有文獻報道，TCP11蛋白質(zhì)在精子獲能和頂體反應(yīng)過程中發(fā)揮作用，可調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶cAMP途徑的活性[20]。在精子獲能后，蛋白激酶A(PKA)依賴性信號傳導(dǎo)途徑的頂體區(qū)域內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化增加[21]。此外，TCP11基因與MAPK家族信號級聯(lián)反應(yīng)MAPK1/MAPK3信號傳導(dǎo)中不依賴RAF的MAPK1/3激活的MAPK3(ERK1)激活有關(guān)。在此途徑中，TCP11基因是參與 pT，Y-MAPK3：MAP2K1的解離，即是MAP2K1(MEK1)從磷酸化的MAPK3(ERK1)解離，從而使p-S202，204-MAP2K二聚化[22]；還參與MAP2K1結(jié)合MAPK3，即是MAP2K1(也稱為MEK1)將MAPK3(ERK1)上的關(guān)鍵Thr202和Tyr204磷酸化，從而將兩個ATP轉(zhuǎn)換為ADP，MAPK3的磷酸化激活其激酶活性。TCP11基因與ZNF143(鋅指蛋白143)有關(guān)系，可激活硒代半胱氨酸t(yī)RNA(tRNAsec)，綁定到小核RNA(snRNA)基因啟動子的SPH基序，通過其與CHD8的相互作用參與有效的U6 RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄。有文獻報道，ZNF143通過PI3K/AKT信號通路促進EMT進程[23]。但是，TCP11基因?qū)MT相關(guān)分子是否有影響還尚不清楚，有待于研究。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TCP11基因在宮頸癌組織中高表達和啟動子低甲基化。這一結(jié)果表明可能是基因啟動子低甲基化，而導(dǎo)致TCP11基因高表達。生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，TCP11基因與宮頸癌患者的年齡和腫瘤分級無顯著相關(guān)性。運用組織芯片、Western blot和實時熒光定量PCR進一步研究，發(fā)現(xiàn)TCP11基因在宮頸癌組織及細(xì)胞均高表達，且與患者年齡及分化程度無顯著相關(guān)性。這一結(jié)果和預(yù)測結(jié)果一致，明確了TCP11基因在宮頸癌組織高表達，但其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制還有待于深入研究。另外，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TCP11基因的低表達與宮頸癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，而其高表達對患者預(yù)后有利。今后將利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗將TCP11基因轉(zhuǎn)到宮頸癌細(xì)胞使其過表達，觀察過表達TCP11基因是否表現(xiàn)出有利于細(xì)胞的表型結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)TCP11蛋白質(zhì)的表達可能不受HPV感染的影響，TCP11與HPV感染的關(guān)系有待深入研究。TCP11基因是否在宮頸癌細(xì)胞中具有影響轉(zhuǎn)移、侵襲能力還需要進一步研究。

綜上所述，TCP11基因在宮頸癌組織和細(xì)胞中高表達，其高表達可能對宮頸癌患者預(yù)后有利，這對發(fā)現(xiàn)宮頸癌生物標(biāo)志物，為預(yù)防、治療宮頸癌及分析宮頸癌的預(yù)后有重要的意義。