趙文年，劉 雙，馬蘭英，徐全武，葉爾加那提，漆雯雯，齊姍姍，張啟耀，韓佳佳，朱夢瑩，馬 莉，葉里哈孜，努爾孜哈

(烏魯木齊縣畜牧獸醫(yī)站，烏魯木齊 830036)

山羊痘(Goat pox)是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，病原為山羊痘病毒(Goat pox virus，GTPV)，癥狀為發(fā)熱、皮膚出現(xiàn)痘疹。 在世界較多國家和地區(qū)常有發(fā)生，造成巨大的畜牧經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。 我國農(nóng)業(yè)部將其確定為一類動(dòng)物傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)也確定為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病[3]。 新疆也有山羊痘疫情發(fā)生[4]。 近年來，隨著烏魯木齊縣羊養(yǎng)殖數(shù)量增加，流通交易頻繁，個(gè)別鄉(xiāng)鎮(zhèn)也有山羊痘發(fā)生。 山羊痘診斷主要依靠臨床癥狀進(jìn)行判斷，采用疫苗免疫后，部分羊不出現(xiàn)明顯痘疹，但仍然帶毒排毒。 烏魯木齊縣獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室無山羊痘病毒病原檢測能力，出現(xiàn)臨床診斷漏診及病毒污染范圍評(píng)估困難。因此，需要建立適合本實(shí)驗(yàn)室條件的檢測方法。本文選取山羊痘病毒p32 基因序列保守區(qū)域作為檢測目的片段，設(shè)計(jì)、合成一對擴(kuò)增引物，成功擴(kuò)增了該目的片段，建立了山羊痘病毒核酸的PCR 檢測方法，為山羊痘病毒的臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DNA 模板及檢測樣品

羊痘疫苗(批號(hào)：2012019)山東綠都生物科技有限公司產(chǎn)品；隨機(jī)采集的羊口腔、鼻腔棉試子30 份。

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑

A100 PCR 儀購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C 型電泳儀購自北京六一儀器廠；GelSMART凝膠儀購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TIANGEN 2×Taq PCR MasterMix 購自TIANGEN；QIAamp MinElute Virus Spin kit 購自QIAGEN；DL 2000 DNA Marker 購自TaKaRa； 引物由上海生工生物科技有限公司合成；Gold View(1000x)購自浙江博而金科技公司；其余輔助試劑為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)、合成

參考p32 基因序列及PCR 檢測研究文獻(xiàn)[6，7]以及GenBank 中公布的山羊痘病毒p32 基因序列(MG458381.1)，使用DNASTAR，比對保守序列，選取檢測目的片段，用Primer 5.0，設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段預(yù)期218 bp。 上游引物：5’GTATTTCTACCAGTTTGAG3’；下游引物：5’CCAATGGATGGGATACAT AGTA 3’；用dd H2O 溶解至100 μmol，-20 ℃保存。

1.2.2 模板DNA 提取

山羊痘疫苗溶解液0.5 mL，按照QIAamp MinElute Virus Spin kit 試劑盒說明書操作，提取山羊痘疫苗DNA，作為模板DNA-20 ℃保存。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL。2×Pfu PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL，dd H2O補(bǔ)至25 μL。 PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃5 min；94 ℃15 s，40 ℃～45 ℃20 s，72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃保存。 1%瓊脂糖凝膠電泳PCR 產(chǎn)物，照膠查看擴(kuò)增條帶大小。

1.2.4 敏感性試驗(yàn)

模板DNA 用核酸測定儀測定濃度，然后進(jìn)行10 倍倍比稀釋，各取5 μL 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對方法的最小靈敏濃度進(jìn)行測試。

1.2.5 樣品檢測

隨機(jī)采集的羊口鼻棉試子樣品30 份，提取DNA 后，按照上述方法PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行山羊痘的診斷，山羊痘疫苗提取DNA 作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 方法的建立

最終反應(yīng)條件為94 ℃5 min；94 ℃15 s，43 ℃20 s，72 ℃30 s， 擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min；4 ℃保存；檢測結(jié)果見圖1。

圖1 GTPV 疫苗的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 PCR 的敏感性

核酸測定儀測定提取DNA 的濃度約為1.82×108拷貝/μL (30 ng/μL)。 結(jié)果稀釋到105(1.82×105拷貝/μL)仍可檢測出條帶，說明該方法具有較高的敏感性，見圖2。

圖2 PCR 敏感性試驗(yàn)

2.3 樣品檢測

陽性對照擴(kuò)增出明顯條帶，隨機(jī)采集的羊口鼻棉試子樣品30 份，均未擴(kuò)增出218 bp 的特異性條帶，見圖3。

圖3 羊口鼻棉試子PCR 檢測試驗(yàn)

3 討論

2019 年烏魯木齊縣出現(xiàn)山羊痘癥狀羊，經(jīng)上級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測為山羊痘病毒核酸陽性。 建立病原診斷的方法是開展病原流行病學(xué)調(diào)查和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的重要手段。 因免疫抗體干擾，用血清學(xué)檢測方法檢測山羊痘效果也不理想[8,9]。同時(shí)血清學(xué)檢測方法耗時(shí)、試劑盒價(jià)格昂貴等原因局限了其在實(shí)際當(dāng)中的應(yīng)用[8，9]。本方法的建立，為山羊痘的臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)[10]。 但因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室無其它DNA 病毒及核酸，無法使用該方法檢測其它(非羊痘)DNA 病毒，未驗(yàn)證本方法的實(shí)驗(yàn)特異性。引物的特異性只是通過BLAST 進(jìn)行了檢索，該方法的特異性為理論結(jié)論，存在一定缺陷[11]。

4 結(jié)論

本文建立了山羊痘病毒PCR 檢測方法，該方法的敏感性濃度為1.82×105拷貝/μL，可儲(chǔ)備為本實(shí)驗(yàn)羊痘病毒病原檢測方法。