金映紅，陳古麗，李 威，夏 俊，汪 萍，苗書(shū)魁，汪 陽(yáng)，李璋赟，古麗扎提·塔力甫汗，木克日木·帕爾哈提，薛 晶*

(1. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊 830000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830000；4.石河子大學(xué)；新疆 石河子 832003)

溶血性曼氏桿菌(Manheimia haemolytica, Mh)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida, Pm)是巴氏桿菌科的典型細(xì)菌，屬于革蘭氏陰性菌，存在于牛、綿羊和山羊等反芻動(dòng)物中，是上呼吸道的常見(jiàn)細(xì)菌。Pm 常引起羊的出血性敗血癥、牛出敗、豬肺疫和禽霍亂等嚴(yán)重性疾病，尤其羊的發(fā)病率、致死率高[1，2]。 曼氏桿菌曾被稱為溶血性巴氏桿菌，是一種嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的人畜共患病原體[3]，臨床上可導(dǎo)致綿羊出血性敗血癥等嚴(yán)重疾病。

一般認(rèn)為，畜禽往往攜帶內(nèi)源性細(xì)菌，當(dāng)出現(xiàn)養(yǎng)殖環(huán)境不衛(wèi)生、天氣忽冷忽熱、活動(dòng)空間狹小、營(yíng)養(yǎng)不良、因天氣原因放養(yǎng)變成圈養(yǎng)等誘因時(shí)，羊會(huì)引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)。 當(dāng)動(dòng)物抵抗病原菌的能力下降時(shí)，細(xì)菌就侵入動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)呼吸道和淋巴管進(jìn)入血液，引發(fā)內(nèi)源性感染[4，5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

采自新疆某羊場(chǎng)病死羊的肺組織。

1.1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BHI 腦心浸液、革蘭氏染色液、各種PCR 所需的酶、DL2000 核酸Marker、藥敏紙片均購(gòu)自賽奧生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；健康巴貝斯小鼠6 只，購(gòu)自新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離

將從羊場(chǎng)采集到的病變組織肺臟分別接種到BHI 液體和固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h 后觀察菌液的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 細(xì)菌鑒定

1.2.2.1 形態(tài)觀察 1.2.1 中的肉湯變渾濁，表明增菌成功，革蘭氏染色鏡檢并拍照記錄。挑取固體平板上光滑、濕潤(rùn)、透明的疑似巴氏桿菌的菌落，接種到腦心浸液肉湯，37 °C，150 r/min，水平振蕩培養(yǎng)，24 h 后染色鏡檢，觀察形態(tài)，選擇純化后的菌液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 PCR 擴(kuò)增 PCR 鑒定采用巴氏桿菌A 和F 型，曼氏桿菌A2 型的引物，擴(kuò)增體系25 μL：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)至25 μL，標(biāo)記好后放到PCR 擴(kuò)增儀中。經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)條件如表1[6，7]。

表1 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件

1.2.2.3 測(cè)序結(jié)果比對(duì) PCR 產(chǎn)物電泳，目的條帶切膠回收，送生工生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Blast搜索GenBank 中的同源序列，分析比較。

1.2.2.4 致病性試驗(yàn) 選6 只小鼠，其中3 只小鼠腹腔注射200 μL 純化菌培養(yǎng)物作為實(shí)驗(yàn)組，另外3 只小鼠腹腔注射生理鹽水200 μL 作為對(duì)照組，觀察各組的食欲和精神狀態(tài)[8]。

1.2.2.5 藥敏實(shí)驗(yàn) 無(wú)菌取純化的細(xì)菌混合液滴入固體平板，滅菌的涂布棒輕輕抹勻，接著將硫酸阿米卡星和頭孢曲松鈉等11 種藥敏片輕輕貼附到培養(yǎng)基表面。 然后將平板放入溫箱，24 h 后觀察結(jié)果[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)特性

如圖1 所示，3 株分離菌a、b、c 革蘭氏染色，顯微鏡下可見(jiàn)a 和b 較小，c 較大，形狀呈球形或桿狀，有單個(gè)的、成對(duì)的和短鏈狀排列的革蘭氏陰性菌。固體平板上的菌落呈現(xiàn)半透明狀，與疑似大腸桿菌的雜菌菌落有明顯差異。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢

2.2 PCR 鑒定結(jié)果及分析

經(jīng)PCR 擴(kuò)增瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，在1100 bp、875 bp 和900 bp 處均出現(xiàn)明亮條帶，見(jiàn)圖2，與預(yù)期相符，說(shuō)明巴氏桿菌A 型、巴氏桿菌F 型和曼氏桿菌A2 型均呈陽(yáng)性。

圖2 PCR 鑒定結(jié)果

2.3 致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組的小鼠注射液體8 h 后表現(xiàn)精神萎頓，厭食，被毛粗糙。 在18 h 內(nèi)相繼死亡。 對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常。 見(jiàn)圖3。

圖3 3 株分離菌液小鼠攻毒試驗(yàn)

2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，混合菌液對(duì)左旋氧氟沙星、乳酸環(huán)丙沙星替敏感，對(duì)其余的藥品不敏感。 見(jiàn)圖4。

圖4 混合菌液藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 防 治

3.1 預(yù)防措施

首先要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，為羊群提供干凈的飲水和食物，及時(shí)將畜舍和羊群活動(dòng)的地方進(jìn)行清理和消毒，定期帶羊進(jìn)行噴霧消毒；其次要定期免疫，細(xì)菌性疾病的常發(fā)地區(qū)要根據(jù)羊的品種、年齡、性別等注射疫苗，減少羊細(xì)菌性傳染病的發(fā)生與傳播；最后，無(wú)害化處理、圈舍消毒，也是很重要的一步。 發(fā)現(xiàn)有癥狀的羊后，應(yīng)立即隔離，對(duì)病死的羊進(jìn)行消毒、深埋無(wú)害化處理，徹底清潔整個(gè)羊場(chǎng)，清潔飼養(yǎng)設(shè)備。

3.2 治療措施

對(duì)已感染的病羊， 建議畜主用2.5%的左旋氧氟沙星或乳酸環(huán)丙沙星按0.1 mL/kg～0.2 mL/kg 體質(zhì)量進(jìn)行肌肉注射，連用4 d，或選用頭孢噻肟、美洛西林、丁胺卡那霉素進(jìn)行肌肉注射(用藥量參照說(shuō)明書(shū))。當(dāng)疫情緩解后，可以用該羊場(chǎng)分離的Pm 和Mh，制備二聯(lián)疫自家菌苗給羊群接種，每只3 mL。

4 討論

分離于新疆某羊場(chǎng)的病羊肺組織的3 株病原菌， 革蘭氏染色呈球桿狀，2 株較小，1 株較大，雖然曼氏桿菌歸屬于巴氏桿菌科，但是形態(tài)上曼氏桿菌相對(duì)較大；測(cè)序結(jié)果及同源比對(duì)，支持3 株菌分別是PmA 型、F 型與MhA2 型。 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出混合菌對(duì)左旋氧氟沙星和乳酸環(huán)丙沙星敏感，這與劉順磊[10]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異。 究其原因，可能是抗菌類藥物的種類和劑量有所不同；巴氏桿菌和曼氏桿菌的混合菌液對(duì)健康小鼠具有一定的致病力，表明其毒力相對(duì)較強(qiáng)；究其原因可能與動(dòng)物的種類有關(guān)，后續(xù)可以在大型動(dòng)物身上做進(jìn)一步的研究，也可以設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的半數(shù)致死量。

以往的文獻(xiàn)表明，羊主要是以B 型Pm 感染為主，F(xiàn) 型的Pm 主要是感染火雞。 但是近年來(lái)通過(guò)研究調(diào)查，我們發(fā)現(xiàn)羊的PmA 型比較多見(jiàn)，F(xiàn) 型也有，在新疆的流行病學(xué)調(diào)查，我們發(fā)現(xiàn)PmA 型和PmF 型以及MhA2 型，是導(dǎo)致羔羊死亡的重要病原，需引起高度重視。

5 結(jié)論

通過(guò)細(xì)菌分離鑒定、PCR 鑒定等實(shí)驗(yàn)判定該病死羊是PmA 型、F 型與MhA2 型混合感染，藥敏實(shí)驗(yàn)判定該混合液對(duì)左氧氟沙星、乳酸環(huán)丙沙星敏感，小鼠致病性試驗(yàn)說(shuō)明，3 株分離菌株對(duì)小鼠有很強(qiáng)的致病能力。 因此，養(yǎng)殖戶在平時(shí)養(yǎng)殖中應(yīng)堅(jiān)持“防大于治”的原則，盡量預(yù)防疾病的發(fā)生，加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)的疾病檢疫相關(guān)檢查，將經(jīng)濟(jì)損失減到最低。