趙志強(qiáng)，張盧慧，趙全新，郭慶元

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國最大的甜菜生產(chǎn)區(qū)，也是我國北方最大的甜菜糖制糖基地[1]。2018年，全區(qū)甜菜種植面積已達(dá)57 260 hm2，占全國種植總面積的26.49%；全區(qū)甜菜總產(chǎn)量為424.73×104t，占全國總產(chǎn)量的37.66%[2]。2016年以來，在新疆多個地區(qū)的甜菜上發(fā)現(xiàn)了一種新病害，可以造成甜菜葉片褪綠、黃化、萎蔫，直至枯死，且半葉發(fā)病者居多。查明引起新疆甜菜黃萎癥狀的病原，研究病害性質(zhì)，需采集病樣，分離純化，運(yùn)用柯赫氏法則驗(yàn)證及對病原物形態(tài)觀察和分子鑒定，研究該病原及所致病害類別，對該病有效防治有實(shí)際意義。【前人研究進(jìn)展】根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在新疆甜菜產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為普遍或?yàn)楹^大的病害有根腐病、立枯病、褐斑病、白粉病和叢根病等[3]。甜菜黃萎病的發(fā)生也有報(bào)道，但迄今國內(nèi)對甜菜黃萎病的認(rèn)識一直是將其作為植原體病害來理解的[4-5]。由于植原體病害在病原鑒定上存在一定的難度，國內(nèi)有關(guān)甜菜黃萎病的報(bào)道多以病害的發(fā)生調(diào)查和防控為主，對其病原菌的研究較少[4-5]。國外曾報(bào)道，變黑輪枝菌(Gibellulopsisnigrescens)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)均為甜菜黃萎病的病原[6-7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆部分甜菜種植區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種與許多作物真菌性黃萎病癥狀類似的甜菜病害，葉片常表現(xiàn)為黃化、萎蔫，直至枯死，且以半葉黃化居多，而國內(nèi)文獻(xiàn)對此尚無報(bào)道。需研究該病病原及病名?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類為基礎(chǔ)，結(jié)合核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)、核糖體大亞基(Large subunit rDNA, LSU)及肌動蛋白(Actin, ACT)基因進(jìn)行多基因系統(tǒng)學(xué)分析，研究該病原物分類地位，并為該病定名，為該病發(fā)生發(fā)展規(guī)律及防治技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年8月在新疆伊寧縣、昌吉市周邊和察布查爾縣等地調(diào)查甜菜病害，從伊犁州伊寧縣阿熱吾斯塘鄉(xiāng)、察布查爾縣奶牛場周邊及昌吉市周邊采集多份具有典型黃萎癥狀的病葉樣品。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法對采集的甜菜病樣分離病原菌。將葉柄用無菌水洗凈、晾干，在超凈臺上用75%乙醇浸潤1 min，在病健交界處切取輕度變色維管束組織(約2 mm×2 mm)用2%NaClO液消毒2 min后，再用無菌水沖洗3次，置于濾紙上晾干，最后放在 PDA培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)。待7 d左右長出菌落后，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲在PDA上進(jìn)行培養(yǎng)，通過單孢分離法獲得各分離物的純培養(yǎng)。將純化的所有菌株(菌株編號：BV1～BV5)在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后保存于4℃冰箱備用。選取典型菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、致病力測定以及分子鑒定。

1.2.2 致病性測定

采用牙簽針刺法[8]測定致病力。將直徑為6 mm的病原分離物菌餅接種在PDA培養(yǎng)基中心，再把10根經(jīng)121℃，30 min滅菌的細(xì)小牙簽(直徑1 mm，長25 mm)尖端向心，呈放射狀排列在菌餅周圍，28℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲覆蓋牙簽尖端約10 mm時，取出帶菌牙簽，針刺接種于室內(nèi)盆栽的甜菜健株(品種新甜6號)的葉柄基部。共接種5株，每株接種3個葉柄，共15個重復(fù)，并以剌入無菌牙簽的健株葉柄(5株，15葉)為對照。接種后將甜菜植株于室內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察，待發(fā)病后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，并從發(fā)病葉片再次分離病原物。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 病原菌的形態(tài)

將回接證病試驗(yàn)確定其致病性的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)20 d左右，觀察并記錄菌落特征和菌體顯微形態(tài)特征，以及是否產(chǎn)生厚垣孢子、休眠菌絲及微菌核等休眠結(jié)構(gòu)。

1.2.3.2 病原菌rDNA-ITS、LSU、ACT片段的PCR擴(kuò)增和序列測定

依據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)鑒定和致病力驗(yàn)證結(jié)果，將分離所得致病菌接種在PDA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)15 d后刮取菌絲，再用液氮將菌絲充分研磨，利用植物基因組提取試劑盒(TIANGEN BIOTECH 公司，DP320-03)提取菌絲基因組DNA。

以25 μL的反應(yīng)體系在PCR儀(DL9700，北京東林昌盛生物科技有限公司)上擴(kuò)增ITS、LSU及ACT基因。反應(yīng)體系如下：2 ×rapPCR Master mix 13 μL，正向、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。ITS基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min,55℃退火1 min，72℃延伸1 min，總共37個循環(huán)，最后72℃延伸10 min；LSU基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，53℃退火55 s，72℃延伸1.5 min，總共28個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。ACT基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下: 94℃預(yù)變性2 min，94℃變性 1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。變黑輪枝菌的ITS、LSU及ACT序列的擴(kuò)增片段及引物。表1

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，以2 000 bp DNA Marker為參照，檢測產(chǎn)物片段大小。上海生工對該擴(kuò)增產(chǎn)物測序，將測序后的序列在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中進(jìn)行序列同源性比對并提交，利用軟件MEGA5.05比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表 1 擴(kuò)增片段及其引物Table 1 Primer sequence for PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

研究表明，在中國新疆伊寧縣、察布查爾縣及昌吉市周邊的甜菜種植區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種與許多作物真菌性黃萎病癥狀類似的甜菜病害，該病害主要癥狀表現(xiàn)在甜菜葉部，感病后輕者葉片黃化萎蔫，植株矮縮，重者枯死，且以中脈為界半葉發(fā)病者較多，疑為甜菜真菌性黃萎病。經(jīng)田間病害高發(fā)期為7～9月，發(fā)病田可見大量的甜菜黃萎病病株。發(fā)病初期一般老葉先黃化，輕病株僅下部葉片黃化枯萎，重病株除心葉外全部葉片黃化枯萎(圖1A)；病葉上有明顯的沿葉脈擴(kuò)展，致脈間黃化(圖1B)，或半葉黃化枯萎(圖1C)。發(fā)病后期感病葉片邊緣向內(nèi)卷曲，萎蔫，直至整個葉片枯死。剖檢葉柄可見維管束略有變色，但不顯著。上述癥狀與茄子黃萎病等多種植物真菌性黃萎病癥狀相似。而在調(diào)查中未見植株明顯矮化，新葉短小、狹窄等癥狀[4]，該病有別于植原體黃萎病。判斷此病為真菌性黃萎病。圖1

圖1 甜菜黃萎病田間癥狀Fig.1 Sugar beet yellow wilt Symptoms on naturally infected leaf

2.2 病原菌的分離及致病性

研究表明，新疆伊寧縣、昌吉市周邊和察布查爾縣等地采集的10份病樣，約40個分離塊上以較高頻率分離到一種與輪枝菌菌落形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)相似的真菌，分離頻率約40%。并純化獲得5個典型菌株。

接種8 d后甜菜幼苗開始顯癥，部分接種葉出現(xiàn)脈間褪綠、黃化，或局部萎蔫干枯等癥狀(圖2A)，接種發(fā)病率約12%。接種15 d后，部分接種葉片黃化、枯死(圖2B)；接種發(fā)病率約為71%；而無菌牙簽接種的幼苗長勢良好未出現(xiàn)發(fā)病癥狀(圖2C)。在被侵染葉片中可再次分離出與接種菌形態(tài)一致病分離物。人工牙簽針刺接種引起的發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀基本一致。圖2

注：A，B.發(fā)病甜菜植株；C.健康甜菜植株

2.3 病原菌的培養(yǎng)性狀及菌體形態(tài)特征

研究表明，菌株在PDA培養(yǎng)基上生長較為緩慢，菌落初期呈白色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，表面常有大小不等的白色菌絲團(tuán)，并產(chǎn)生灰白色粉末及同心輪紋，邊緣較為整齊，培養(yǎng)后期菌落逐漸變?yōu)榛液谏?，菌落背面灰黑至黑?圖3A)。菌絲體中有明顯的輪枝狀分生孢子梗，分生孢子梗細(xì)長無色，常有二次輪狀分枝，即分支小梗輪生于分生孢子梗上，產(chǎn)孢小梗又呈輪枝狀著生于分生小梗上，一般每輪3～4根小枝并常在枝端聚集成容易散落的孢子球(圖3B)，長度為25～45 μm(30 μm avg.)。分生孢子無色透明，呈圓形或橢圓形，大小為3.7～6.8×1.8～3 μm(n=100)(圖3C)；其休眠體為厚垣孢子，卵圓形、球形或不規(guī)則形，深褐色，一般3～5個串生，直徑5.5～8.5 μm(n=100)，成熟后彼此間分散(圖3D)；不產(chǎn)生微菌核與休眠菌絲。與大麗輪枝菌有明顯區(qū)別，而與已報(bào)道的Gibellulopsisnigrescens[7]的形態(tài)描述比較一致。圖3

注：A.PDA培養(yǎng)基上的菌落；B.分生孢子梗；C.分生孢子；D.厚垣孢子 標(biāo)尺：B,C,D=20 μm

2.4 病原菌ITS、LSU及ACT序列

研究表明，對BV4菌株ITS、LSU、ACT區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物序列測定，分別獲得長度為525、879和261 bp的片段。將所測菌株序列提交至GenBank，獲得序列登陸號分別為MG824977.1、MH229355.1和MN700655.1。利用該菌株序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，確定親緣關(guān)系最近的種屬。從數(shù)據(jù)庫中獲得相關(guān)序列，通過軟件MEGA5.05，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示：菌株BV4的ITS序列與G.nigrescens(MG855143.1)在同一分支，同源性為99%；LSU序列與Gibellulopsisnigrescens(MH866593.1)在同一分支，同源性為99%；ACT序列與Gibellulopsisnigrescens(JN18840.1)在同一分支，同源性為100%。

甜菜真菌性黃萎病的病原菌為變黑輪枝菌(Gibellulopsisnigrescens)，其病害為甜菜真菌性病害，可命名為甜菜黃萎病(Sugar beet Gibellulopsis yellow wilt)。圖4～圖7

圖4 基于ITS、LSU、ACT基因擴(kuò)增的電泳圖Fig 4. The PCR amplification product of ITS、LSU and ACT sequences

圖5 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on rDNA-ITS sequence

圖6 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的LSU序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on rDNA - LSU sequence

圖7 甜菜黃萎病病原菌菌株BV4的ACT序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of the pathogenic strain BV4 based on ACT sequence

3 討 論

Pethybridge[12]在1917年從馬鈴薯塊莖中分離得到一種真菌，通過形態(tài)學(xué)的分類方法將其歸屬于Plectosphaerellaceae科Verticillium屬，并將其命名為VerticilliumnigrescensPethybr.(中文譯名為變黑輪枝菌)。在2007年，對該菌ITS和LSU序列的進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株歸屬于Plectosphaerellaceae科，Gibellulopsis屬，最終將其拉丁名定名為Gibellulopsisnigrescens[7,13]。在2011年，Inderbitzin等[14]又基于多個基因?qū)喼⒘诵碌姆诸惪蚣?，Verticillium屬內(nèi)共包含10個種，并又將黑白輪枝菌細(xì)分為3個種，即為黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)、苜蓿輪枝菌(Verticilliumalafalfae)和非苜蓿輪枝菌(Verticilliumnonalfalfa)。G.nigrescens與Verticillium屬內(nèi)種不易區(qū)分，但各菌種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后均菌絲休眠結(jié)構(gòu)略有不同。黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)分別以暗褐色菌絲體或菌核作為休眠結(jié)構(gòu)；三體輪枝菌(Verticilliumtricorpus)可同時產(chǎn)生厚垣孢子、休眠菌絲、微菌核3種休眠體；云狀輪枝菌(Verticilliumnubilum)和變黑輪枝菌(G.nigrescens)僅可產(chǎn)生深褐色厚垣孢子，而云狀輪枝菌厚垣孢子的直徑(8.4～17.5 μm)明顯大于G.nigrescens的直徑(5.3～8.1 μm)[12,15-17]。由于G.nigrescens在形態(tài)上與輪枝菌屬內(nèi)近似種的分生孢子梗大小、輪狀分枝小梗數(shù)目、分生孢子大小上的差異不明顯，而且隨著培養(yǎng)環(huán)境的變化，一些形態(tài)特征可能不會穩(wěn)定表現(xiàn)，僅從形態(tài)上區(qū)分仍然較為困難[18]。

真菌ITS序列是介于與5.8S rRNA、18S rRNA及28S rRNA之間的區(qū)域，其序列不加入成熟核糖體，進(jìn)化速率較快且更易突變累計(jì)，其在種內(nèi)高度保守，種間差異較為明顯。屬內(nèi)種間和亞種間的分類鑒定常以ITS序列為依據(jù)[19]。近年來，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在種內(nèi)鑒定中ITS的區(qū)分度不是很理想，這說明利用單獨(dú)特定片段作為DNA條形碼具有一定的局限性。因此，結(jié)合其他序列作為輔助鑒定就顯得很有必要[20]。核糖體大亞基(LSU)序列是一段相對保守的位于25～28S的RNA序列[21]，Zare通過分析LSU序列，完成了輪枝菌屬內(nèi)種間的物種鑒定，并發(fā)現(xiàn)新的分類單元。ITS與LSU序列已逐漸成為鑒定大部分絲狀真菌的DNA條形碼[22]。ACT基因也常作為多基因聯(lián)合鑒定中的基因之一來區(qū)分輪枝菌屬內(nèi)種與G.nigrescens[14]，在菌物鑒定過程中，采用多基因位點(diǎn)來識別和鑒定已逐漸成為趨勢。因此，研究分析了變黑輪枝菌的ITS、LSU及ACT序列，也證明這3個基因可以將變黑輪枝菌與其它近似種進(jìn)行區(qū)分。其中，分離菌株的ACT基因與G.nigrescen的ACT基因的同源性高達(dá)100%，且在該序列比對結(jié)果中未出現(xiàn)輪枝菌屬相關(guān)種，因此，目前可將ACT基因作為首選片段將其近似種區(qū)分，從而達(dá)到快速鑒定的目的。

甜菜黃萎病的病原菌包括變G.nigrescens和V.dahliae，但關(guān)于甜菜來源的G.nigrescens報(bào)道甚少。多地曾報(bào)道甜菜黃萎病的發(fā)生，經(jīng)鑒定其病原菌均為V.dahliae[6,23-25]。而Zare[7]在2007年曾報(bào)道G.nigrescens可引起甜菜黃萎病，這與研究結(jié)果一致。研究從采集到的甜菜病株上未分離出V.dahliae，可能與采集的病樣數(shù)較少有關(guān)。新疆甜菜種植區(qū)分布較廣，甜菜真菌性黃萎病是否存在由V.dahliae與G.nigrescens復(fù)合侵染的情況，有待于廣泛采樣開展進(jìn)一步研究。

20世紀(jì)70、80年代，國內(nèi)外大量報(bào)道均將植原體作為甜菜黃萎病病原，其癥狀描述也與研究觀察到的癥狀有不少相似之處，是否存在植原體、G.nigrescens、Verticillium屬內(nèi)致病種混合侵染的情況或其病原種類是否存在地域差異有待進(jìn)一步研究。

目前，國內(nèi)還未見甜菜來源的G.nigrescens的報(bào)道，但據(jù)已有報(bào)道，G.nigrescens寄主種類較為繁多[26]。1982年，陳吉棣[27]從馬鈴薯、菜豆、茄子、豇豆和芹菜等植物上分離出G.nigrescens；1987年，王克榮[28]從棉花黃萎病病株中分離出G.nigrescens，并發(fā)現(xiàn)其在棉花上表現(xiàn)弱致病力；2009年，段維軍[29]在寧波從進(jìn)境芹菜中分離出G.nigrescens；2010年，Hu等[30]從苜蓿分離出一株G.nigrescens。該菌寄主范圍較廣。今后宜對各寄主的危害情況及該菌在甜菜等多種作物的潛在風(fēng)險(xiǎn)評估，以及針對該病害的控制方法開展進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

新疆甜菜真菌性黃萎病的病原菌為變黑輪枝菌，其病害可命名為甜菜黃萎病，是變黑輪枝菌在甜菜上的國內(nèi)新寄主記錄。