廖盛楠呂煒桐唐權(quán)馬玗玟劉力嘉王亮彭顯

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正畸科，成都61004；

2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都610041

變異鏈球菌（Streptococcusmutans，S.mutans）是引起齲齒的主要病原菌，在人的牙齒表面生長(zhǎng)并分泌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、葡聚糖結(jié)合蛋白等，以形成牙菌斑[1-2]。長(zhǎng)期以來(lái)，氟、氯己定和其他抗菌藥物是齲齒治療的常規(guī)方法[3-4]。然而，變異鏈球菌對(duì)這些抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥性已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的挑戰(zhàn)[5-6]。開(kāi)發(fā)一種新藥需要大量的勞動(dòng)力、資金和時(shí)間成本，藥物再利用是指在臨床上已經(jīng)廣泛使用的藥物基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)新的治療效果，是臨床上開(kāi)發(fā)新藥的的替代選擇。近年來(lái)，小分子藥物防齲研究引起廣泛關(guān)注。通過(guò)對(duì)大量小分子化合物、天然產(chǎn)物等化合物庫(kù)的篩選，再通過(guò)靶點(diǎn)分析，尋求更能結(jié)合其靶蛋白活性位點(diǎn)的小分子，最終找到具有選擇性、特異性抑制致齲菌及牙菌斑生物膜形成的小分子藥物，達(dá)到開(kāi)發(fā)新型抗齲藥物的目的。

選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（selective estrogen receptor modulators，SERMs）是一類美國(guó)食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的作用于雌激素受體的藥物。與純雌激素受體激動(dòng)劑和拮抗劑不同，其因在不同組織中的作用不同而具有選擇性地抑制或刺激雌激素樣作用。臨床常用的SERMs包括他莫昔芬、托瑞米芬、克羅米芬和雷洛昔芬。他莫昔芬是雌激素受體陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的一線激素治療藥物；托瑞米芬是一種氯化他莫昔芬衍生物，與他莫昔芬相比，在肝臟中產(chǎn)生的DNA加合物更少，并且被開(kāi)發(fā)用于避免肝癌；克羅米芬是一種用于治療未排卵婦女（包括多囊卵巢綜合征婦女）不育癥的藥物；雷洛昔芬用于預(yù)防和治療高危婦女中的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和乳腺癌[7-9]。SERMs還具有抗菌、抗病毒和神經(jīng)保護(hù)作用，已經(jīng)有少數(shù)研究[8，10-12]顯示了SERMs對(duì)革蘭陰性細(xì)菌具有有效的抗菌性能。但目前仍然缺乏對(duì)SERMs藥物系統(tǒng)的篩選，并且較少研究它們對(duì)口腔致齲菌，如變異鏈球菌的抗菌作用，且具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。

轉(zhuǎn)座子插入為細(xì)菌基因組的隨機(jī)突變提供了一種有效方法，已被廣泛用于細(xì)菌發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)研究中。課題組前期基于Himar1的轉(zhuǎn)座子的自殺載體pMagellan6，開(kāi)發(fā)了變異鏈球菌突變體庫(kù)。Himar1是mariner家族的轉(zhuǎn)座子，利用Himar1轉(zhuǎn)座酶的點(diǎn)突變體增加了該酶的轉(zhuǎn)座率，使其能被開(kāi)發(fā)成為基因操作的工具。Himar1轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的唯一序列要求是TA二核苷酸序列。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)座子插入的確切位置的鑒定即可找到突變基因位點(diǎn)。一種對(duì)Himar1轉(zhuǎn)座子非常有效的方法是在轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列中引入限制性內(nèi)切酶MmeⅠ識(shí)別位點(diǎn)。用它消化基因組時(shí)，MmeⅠ會(huì)從識(shí)別位點(diǎn)側(cè)向消化20 bp序列，產(chǎn)生一個(gè)包含轉(zhuǎn)座子和反向重復(fù)序列的片段。通過(guò)特定的Illumina兼容序列連接到轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的突出端堿基上，然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和Illumina深度測(cè)序，即可精確定位插入位點(diǎn)。

本研究旨在建立基于Himar1轉(zhuǎn)座子的變異鏈球菌突變體庫(kù)，可以通過(guò)大量突變體篩選探索抗菌藥物的作用位點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)菌復(fù)蘇和培養(yǎng)

取-80℃凍存的變異鏈球菌UA159標(biāo)準(zhǔn)菌株，室溫下解凍后接種于腦心浸出液（brain heart infusion agar，BHI）瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧箱（80%N2，10%CO2，10%H2）內(nèi)復(fù)蘇24 h，挑取單克隆菌株繼續(xù)培養(yǎng)24 h后制備細(xì)菌懸液，用PBS將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×106CFU·mL-1，4℃?zhèn)溆谩y帶質(zhì)粒的大腸桿菌菌株在含有紅霉素（12μg·mL-1）的Luria-Bertani（LB；Difco）培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。

1.2 藥物的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)中所有使用的FDA批準(zhǔn)的小分子化合物都購(gòu)買于成都寶科生物科技有限公司。其中SERMs包括托瑞米芬、他莫昔芬、克羅米芬和雷洛昔芬。將藥物制備了一系列濃度的稀釋液：將所有藥物分別溶于DMSO中，稀釋至50、25、12.5、6.25、3.125、1.56μmol·L-1的濃度。

1.3 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值的測(cè)定

使用微量稀釋法測(cè)定小分子化合物對(duì)變異鏈球菌UA159的MIC值。將稀釋后不同濃度的小分子藥物溶液分別加到滅菌的96孔板中，第1至第11孔加藥液，每孔10μL，第12孔加入等量無(wú)菌PBS作為陰性對(duì)照。將單克隆的UA159菌落在BHI液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇一夜，用BHI將菌液稀釋20倍后再生長(zhǎng)至OD470為0.6，并每孔加入2μL到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。然后在5%CO2下厭氧培養(yǎng)16 h，并通過(guò)酶標(biāo)儀記錄每個(gè)孔在OD600的光密度（optical density，OD）值。以在孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC，當(dāng)對(duì)照孔（即PBS組）內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)才有意義。

1.4 變異鏈球菌突變體庫(kù)的構(gòu)建

利用mini-Himar1轉(zhuǎn)座子構(gòu)建變異鏈球菌的突變體庫(kù)[13]。從異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)的大腸桿菌中分離出含有MarC9轉(zhuǎn)座酶的粗提取物，然后通過(guò)親和色譜法使用淀粉樹(shù)脂柱純化該酶。MarC9轉(zhuǎn)座酶純化后，用8%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析測(cè)定最終產(chǎn)物的純度。使用1μg細(xì)菌DNA和1μg Magellan6在2 mL培養(yǎng)基中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座。在轉(zhuǎn)座酶MarC9介導(dǎo)下，含有壯觀霉素和紅霉素抗性的Magellan6通過(guò)剪貼機(jī)制被引入線性的細(xì)菌基因組DNA片段中。轉(zhuǎn)座后，每個(gè)轉(zhuǎn)座子和線性基因組DNA的連接處存在單鏈的間隙，用T4DNA聚合酶和大腸桿菌DNA連接酶進(jìn)行修復(fù)。

隨后，包含Magellan6插入片段的線性基因組DNA被轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中。即在BHI中過(guò)夜培養(yǎng)的變異鏈球菌的菌株被1∶10/1∶20/1∶30稀釋，并在37℃中厭氧培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.2～0.3（約2～3 h）。培養(yǎng)物在室溫下靜置10 min。在1.5 mL離心管中，將1μg的用于轉(zhuǎn)化的DNA加入500～1 000μL細(xì)胞培養(yǎng)液中，并以30℃厭氧額外培養(yǎng)2～3 h。在培養(yǎng)之后稀釋細(xì)胞，將一部分涂板于含有抗生素的BHI選擇培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)，直到可見(jiàn)菌落。

1.5 插入位點(diǎn)的鑒定

從選擇培養(yǎng)基上挑選出成功轉(zhuǎn)座的突變體菌株后，識(shí)別轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座子左右兩端的反向重復(fù)序列里設(shè)計(jì)有MmeⅠ識(shí)別序列，用ⅡS型限制酶MmeⅠ對(duì)轉(zhuǎn)座子插入的突變體的基因組DNA進(jìn)行消化。MmeⅠ在其識(shí)別位點(diǎn)的下游切割了20個(gè)bp的序列。產(chǎn)生的一部分DNA片段包含了轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列和20 bp的側(cè)翼DNA。預(yù)先制備一種特定的Illumina兼容序列，并存儲(chǔ)在

-20℃。

用DNA連接酶在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的突出端堿基連接上Illumina兼容序列，并在16℃培養(yǎng)一夜，即產(chǎn)生120 bp的插入位點(diǎn)片段。應(yīng)用PFU超緩沖液、dNTPs、引物P1_M6_MmeI、Gex PCR引物2和PFU超聚合酶等進(jìn)行PCR以擴(kuò)增序列。通過(guò)Illumina深度測(cè)序，即可精確定位插入位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 抑制變異鏈球菌的小分子化合物的篩選

作為FDA批準(zhǔn)的藥物，這些藥物的生物安全性已經(jīng)得到了測(cè)試和保證。用微量稀釋法測(cè)定了426個(gè)FDA批準(zhǔn)的小分子化合物對(duì)變異鏈球菌UA159的MIC。研究發(fā)現(xiàn)，這些小分子化合物中有18種小分子抑制劑對(duì)變異鏈球菌具有抗菌效果，分別屬于以下類別（表1）。除了傳統(tǒng)抗生素外，還發(fā)現(xiàn)了以往認(rèn)為與抗菌活性無(wú)關(guān)的藥物。在確定的具有抗菌特性的18種小分子化合物中，有4種屬于選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，結(jié)構(gòu)存在差異（圖1），展現(xiàn)出良好的抗菌能力。

圖1 篩選出的4種SERMs的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structuresof four selected SERMs

表1 篩選出的具有抑制變異鏈球菌活性的小分子化合物Tab 1 Selected small molecular inhibitors which have anti-S.mutans activities

2.2 變異鏈球菌突變體庫(kù)的成功構(gòu)建

為了研究SERMs的抗菌機(jī)制，以克羅米芬為例進(jìn)行探索。利用Himar1 Mariner轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建了變異鏈球菌的突變體庫(kù)。其中包括一系列的實(shí)驗(yàn)：MarC9酶的純化、Magellan6的轉(zhuǎn)化和突變株的篩選。為了在體外轉(zhuǎn)化Magellan6，成功地構(gòu)建了質(zhì)粒PVPT作為載體。從IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌中分離并純化MarC9轉(zhuǎn)座酶后，用于之后的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中。在誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入感受態(tài)后，含有轉(zhuǎn)座子的DNA被轉(zhuǎn)化入變異鏈球菌中。采用含有壯觀霉素的培養(yǎng)基驗(yàn)證變異鏈球菌是否轉(zhuǎn)化成功。Magellan6上攜帶有壯觀霉素抗性，因此沒(méi)有成功轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌將被抑制生長(zhǎng)。對(duì)于成功轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，在37℃的選擇性BHI平板上可以看到菌落，得到了成功轉(zhuǎn)化的突變體（圖2A）。為了確認(rèn)轉(zhuǎn)座子是否成功插入菌株，在提取細(xì)菌DNA后，通過(guò)PCR擴(kuò)增了120 bp的插入位點(diǎn)片段。10個(gè)隨機(jī)挑選的單個(gè)菌落均出現(xiàn)了120 bp序列片段對(duì)應(yīng)的條帶（圖2B）。

圖2 變異鏈球菌突變體的成功轉(zhuǎn)化Fig 2 Thesuccessful transformation of S.mutans

通過(guò)對(duì)這120 bp的片段的測(cè)序可以確定轉(zhuǎn)座子插入的位置。因此，對(duì)片段進(jìn)行了測(cè)序，并在變異鏈球菌的基因組進(jìn)行了比對(duì)，證實(shí)了突變體庫(kù)中不同位點(diǎn)的隨機(jī)插入。在以上10個(gè)被測(cè)序的菌落中，9個(gè)呈陽(yáng)性插入，插入位點(diǎn)的識(shí)別如下（表2）。

表2 變異鏈球菌突變體的插入位點(diǎn)的鑒定Tab 2 Identification of the insertion sites of S.mutans

通過(guò)菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，從4個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中收集了大約45 000個(gè)轉(zhuǎn)座子插入突變體。而變異鏈球菌UA159共有約2 160個(gè)基因，數(shù)目龐大的隨機(jī)突變足以覆蓋其全部非必須基因，此突變體庫(kù)可以作為研究藥物作用靶點(diǎn)的有效工具。

2.3 SERMs抗菌機(jī)制的探索

由于DNA片段的體外轉(zhuǎn)座和隨后質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化都是低頻事件，絕大多數(shù)的突變菌株都只有單個(gè)轉(zhuǎn)座子插入。為了篩選出具有克羅米芬抗性的突變體，將突變體庫(kù)的不同菌株添加到含克羅米芬的BHI瓊脂平板上。在37℃下培養(yǎng)48～72 h后，最終獲得了2個(gè)抗克羅米芬的突變菌株。在沒(méi)有克羅米芬的條件下培養(yǎng)至少30代后，2個(gè)突變體的菌株仍然可以表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗克羅米芬的表型，結(jié)果表明這2種突變體的耐藥性與轉(zhuǎn)座子插入密切相關(guān)。對(duì)DNA序列的測(cè)序分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)位于smu_546、smu_874的基因中（圖3）。

圖3 不同的變異鏈球菌突變株在克羅米芬中的生長(zhǎng)情況。其中TnSm-1（smu-546基因突變）和TnSm-2（smu-874基因突變）兩個(gè)菌株具有克羅米芬抗性Fig 3 The growth condition of different mutant strains in clomiphene.Two mutant strains，TnSm-1(Smu-546 gene mutation)and TnSm-2(Smu-874 genemutation)，werefound to beresistant to clomiphene

3 討論

齲病是一種慢性細(xì)菌感染性疾病，氟化物、氯己定和其他抗菌的藥物長(zhǎng)期使用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，促使去探尋更有效地對(duì)抗變異鏈球菌的藥物，以實(shí)現(xiàn)齲病的防治。從FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的藥物中開(kāi)發(fā)新的抑菌功能是一個(gè)很好的方向。本實(shí)驗(yàn)從FDA批準(zhǔn)的藥物中發(fā)現(xiàn)了SERMs這類藥物具有良好的抑菌效果，并系統(tǒng)地探究其抗菌作用。盡管近年來(lái)SERMs的抑菌能力受到了一定關(guān)注，但對(duì)口腔致齲菌——變異鏈球菌的抑制作用探究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立變異鏈球菌的突變體庫(kù)，進(jìn)一步探究SERMs的作用機(jī)制。將SERMs和臨床中最常見(jiàn)、最有效的口服抗菌劑相比，SERMs比臨床中使用的氯己定具有更低的抑菌濃度[14]。氯己定通過(guò)改變細(xì)菌生物膜的滲透性來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，且具有一定的不良反應(yīng)。由于抑菌機(jī)制的不同，SERMs可能解決變異鏈球菌產(chǎn)生的耐藥性的問(wèn)題。此外，與氯己定一樣，SERMs在其表面具有正電荷，這有助于藥物與牙菌斑結(jié)合，并穩(wěn)定地釋放藥物[15]。

在之前的研究中，克羅米芬通過(guò)抑制十一異戊烯二磷酸合酶（Undecaprenyl-diphosphate synthase，UPPS）來(lái)抑制金黃色葡萄球菌，該合成酶負(fù)責(zé)合成的十一異戊烯二磷酸是脂質(zhì)載體Und-P的直接前體，從而降低了用于合成磷壁酸（wall teichoic acid，WTA）的Und-P，對(duì)細(xì)胞壁產(chǎn)生作用[16]?？肆_米芬與β-內(nèi)酰胺在抑制金黃色葡萄球菌方面具有協(xié)同作用，這可能歸因于UPPS的抑制降低了脂質(zhì)Ⅱ，而脂質(zhì)Ⅱ被用作PBPs的轉(zhuǎn)糖基作用和轉(zhuǎn)肽作用的底物。然而，克羅米芬對(duì)不同的細(xì)菌種類可能具有不同的抗菌機(jī)制。變異鏈球菌的突變體庫(kù)提供了2個(gè)對(duì)克羅米芬耐藥的菌株。對(duì)這兩個(gè)菌株的DNA序列分析表明，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)位于smu_546、smu_874的基因中。smu_546編碼一種推定的三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白，它是一種參與應(yīng)激反應(yīng)的膜GTP酶。smu_874編碼一種雙功能的同型半胱氨酸S甲基轉(zhuǎn)移酶/5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶蛋白。然而，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證是否是這2個(gè)基因的突變導(dǎo)致了變異鏈球菌對(duì)克羅米芬的耐藥性的產(chǎn)生。其他SERMs藥物，例如托瑞米芬和他莫西芬，通過(guò)將細(xì)菌的細(xì)胞膜去極化和滲透作用，誘導(dǎo)離子流出，導(dǎo)致跨膜電位的喪失，嚴(yán)重破壞膜的形成和導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的膨脹，也作用于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞裂解[17-20]。作為同一類藥物，克羅米芬與它們具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可能具有相似的機(jī)制影響變異鏈球菌。

檸檬酸克羅米芬已被用于臨床治療，其安全性問(wèn)題不容忽視。許多臨床試驗(yàn)和Meta分析系統(tǒng)地研究和介紹了與它的安全性有關(guān)的問(wèn)題。臨床上，使用大劑量的克羅米芬治療與多胎妊娠、先天性血管瘤和卵巢癌有關(guān)[21-22]。在本研究中，克羅米芬的MIC僅為3.125μmol·L-1，治療口腔感染所需的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于安全范圍[23-25]。在細(xì)菌生物膜的影響下，不同藥物在體內(nèi)的實(shí)際抗菌效果可能不同。大量的研究[26]表明，由于生物膜的保護(hù)作用，變異鏈球菌在生物膜中對(duì)抗菌劑的敏感度遠(yuǎn)低于體外的浮游狀態(tài)，因此，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究SERMs在體內(nèi)的抗菌作用及其防齲效果?？谇坏纳鷳B(tài)環(huán)境是一個(gè)由多種細(xì)菌相互作用的復(fù)雜環(huán)境，SERMs藥物是否只特定地針對(duì)變異鏈球菌發(fā)揮抗菌作用，或者對(duì)其他口腔細(xì)菌也產(chǎn)生相應(yīng)的影響，進(jìn)而調(diào)控口腔微生態(tài)的平衡，也需要進(jìn)一步的研究。

不同的SERMs抑菌作用明顯不同，可能是由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同?？肆_米芬、他莫昔芬和托瑞米芬對(duì)變異鏈球菌有良好的抗菌活性。它們都是三苯乙烯類衍生物。雖然目前尚不能確定三苯乙烯的結(jié)構(gòu)是否與其抗菌活性有關(guān)，但據(jù)報(bào)道[27]，三苯乙烯結(jié)構(gòu)的變化會(huì)顯著影響其抗感染活性。也有研究[28]記錄了三苯乙烯通過(guò)干擾鈣的穩(wěn)態(tài)達(dá)到了抗真菌作用。需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確定這些藥物的抗菌機(jī)制與此結(jié)構(gòu)有關(guān)，也可能通過(guò)修飾三苯基乙烯類藥物上的基團(tuán)來(lái)合成更適合抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。