徐 倩 鄭萍萍 惠燦燦 陸雅婷 王 林 陳明衛(wèi) 劉建軍 鄧大同

自身免疫性甲狀腺疾?。╝utoimmune thyroid disease，AITD）屬于一種器官特異性自身免疫性疾病，是育齡期婦女最常見的甲狀腺疾病[1]。甲狀腺自身免疫（TAI）的主要特征是自身免疫性甲狀腺抗體如抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）水平升高。研究表明，TPOAb或TgAb在妊娠期婦女中的陽性率達(dá)2%～17%[2]。文獻(xiàn)證實(shí)，患TAI的女性在妊娠過程中發(fā)生妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、甲狀腺功能異常等風(fēng)險(xiǎn)增加，對(duì)妊娠結(jié)局及后代發(fā)育產(chǎn)生不良影響[3-4]。而妊娠前女性患有TAI一般臨床癥狀較隱匿，無特異性，易被忽視。近年來有研究認(rèn)為女性孕前篩查自身免疫性甲狀腺抗體具有重要意義[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在建立實(shí)驗(yàn)性TAI模型，初步探討孕前TAI對(duì)后代學(xué)習(xí)記憶能力的影響及可能的機(jī)制，進(jìn)一步分析孕前篩查自身免疫性甲狀腺抗體的必要性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循《安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》。SD大鼠（4～5周齡，200～250 g）購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SD雌鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，隨機(jī)分為對(duì)照組（CON組）和甲狀腺自身免疫組（TAI組），每組8只。

1.2 試劑及儀器 豬甲狀腺球蛋白（pTg）、完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA）均購自美國Sigma公司；TgAb、TPOAb測(cè)定試劑盒均購自美國西門子醫(yī)學(xué)診斷股份有限公司；形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（Image-ProPlus 6.0）來自美國MEDIA CYBERNETICS 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TAI動(dòng)物模型制備 參考文獻(xiàn)[6]制備動(dòng)物模型，將pTg與生理鹽水混合溶解成2 mg/mL溶液，與CFA按照1∶1體積比混合，反復(fù)研磨至完全乳化。以每只大鼠pTg100 μg多位點(diǎn)皮下注射進(jìn)行初次免疫。CON組注射等量不含pTg的CFA乳化劑。每周1次，從第3周至第6周，用IFA代替CFA制備乳液，其余操作方法同前。7周后，隨機(jī)將3只雌鼠與1只未經(jīng)處理的SD雄鼠合籠交配。觀察到陰道黏液栓的早晨為胚胎第0天（第0天），分娩日設(shè)定為后代生后第0天。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查。

1.3.2 血清抗甲狀腺抗體測(cè)定 造模結(jié)束后，雌鼠采用眶靜脈采血約1 mL，高速離心機(jī)3000 r/min，離心15 min，分離血清。采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）檢測(cè)血清TgAb和TPOAb水平。

1.3.3 莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)（MWM） 采用MWM實(shí)驗(yàn)測(cè)試學(xué)習(xí)記憶能力。每組隨機(jī)抽取8只生后30天的仔鼠進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)。水池直徑180 cm，水深30 cm，水溫（22±2）℃。分為4個(gè)象限。本實(shí)驗(yàn)選擇第3象限放置一個(gè)頂面為10 cm×10 cm的平臺(tái)，低于水面2 cm。MWM分為兩個(gè)部分：一是定位航行實(shí)驗(yàn)，共連續(xù)進(jìn)行5天，每天下午進(jìn)行4次測(cè)量。仔鼠面向池壁分別從4個(gè)不同象限入水。找到平臺(tái)后，在平臺(tái)上停留20 s，休息60 s，然后從下一象限隨機(jī)入水。記錄仔鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。如果仔鼠入水后60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，操作者將幫助其上平臺(tái)，即本實(shí)驗(yàn)中的最大逃避潛伏期為60 s。二是空間探索實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)開始后的第6天拆除平臺(tái)，將仔鼠從第1象限面向池壁放入水中，觀察并記錄每只仔鼠90 s內(nèi)在第3象限內(nèi)滯留時(shí)間及穿過原始平臺(tái)的次數(shù)。

1.3.4 海馬組織標(biāo)本制備 仔鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日，經(jīng)水合氯醛麻醉后，解剖仔鼠，暴露心臟，剪開右心耳，自心尖部快速滴入生理鹽水，至流出液清澈，肝臟變白，繼續(xù)注入4%的多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，留取新鮮腦海馬組織，4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片。

1.3.5 蘇木精伊紅染色（HE） 仔鼠腦海馬組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、復(fù)水后，進(jìn)行蘇木精染色，鹽酸乙醇返藍(lán)，伊紅水溶液染色，再經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，最后封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

1.3.6 尼氏染色 取仔鼠海馬組織切片，常規(guī)脫蠟至水，用1%甲苯胺藍(lán)水溶液進(jìn)行染色，染色20分鐘后沖洗多余的染色，乙醇分化、脫水，二甲苯透明后中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

1.3.7 免疫組化染色 免疫組化法檢測(cè)成熟神經(jīng)元核蛋白（NeuN）和突觸相關(guān)蛋白（SYN）的表達(dá)。仔鼠海馬組織切片常規(guī)脫蠟至水，浸入檸檬酸鹽修復(fù)液500 mL微波修復(fù)，水浴冷卻。滴加3%H2O2孵育20 min，PBS緩沖液漂洗3次后，滴加適當(dāng)稀釋的NeuN、SYN一抗，4℃孵育過夜。PBS漂洗3次，分別滴加二者相應(yīng)抗小鼠/兔二抗。再次PBS漂洗3次，加入DAB顯色液。蘇木精復(fù)染、藍(lán)化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、封片，光學(xué)顯微鏡下采集圖片，分析平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有圖表均使用GraphPad Prism 7.04制作。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）描述，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組雌性大鼠血清抗體水平 TAI組大鼠血清TgAb、TPOAb水平均顯著高于CON組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 行為學(xué)指標(biāo)

2.2.1 定位航行試驗(yàn) 數(shù)據(jù)顯示，在定位航行測(cè)試中，各組仔鼠到達(dá)平臺(tái)的逃避潛伏期均表現(xiàn)逐漸縮短。第5天，TAI組仔鼠到達(dá)平臺(tái)的潛伏期與CON組相比顯著延長（P＜0.05），見圖2A。

2.2.2 空間探索試驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAI組仔鼠在平臺(tái)所在象限的滯留時(shí)間明顯短于CON組仔鼠（P＜0.05）；TAI組仔鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著低于CON組仔鼠（P＜0.05），見圖2B。

圖2 各組仔鼠MWM實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 海馬組織形態(tài) HE染色觀察到各組海馬組織結(jié)構(gòu)CA1區(qū)域結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)多而清晰，無水腫。尼氏染色觀察到CA1區(qū)神經(jīng)元完整，排列致密，細(xì)胞核大而圓，胞漿呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有豐富的尼氏小體，錐體層細(xì)胞排列整齊，呈錐體或球形，胞漿呈深藍(lán)色，未觀察到明顯的神經(jīng)元丟失。TAI組和CON組之間沒有顯著差異，見圖3。

圖3 各組仔鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元HE染色和尼氏染色結(jié)果

2.4 海馬組織NeuN、SYN表達(dá)情況 ①各組仔鼠海馬NeuN表達(dá)水平：與CON組相比，TAI組仔鼠海馬組織CA1區(qū)NeuN陽性細(xì)胞的平均光密度顯著降低（P＜0.05），提示NeuN蛋白表達(dá)降低，見圖4A。②各組仔鼠海馬 SYN表達(dá)水平：與CON組相比，TAI組仔鼠海馬組織CA1區(qū)SYN平均光密度顯著降低（P＜0.05），提示SYN蛋白表達(dá)降低，見圖4B。

圖4 各組仔鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元NeuN、SYN蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討 論

甲狀腺自身免疫是育齡期婦女甲狀腺功能減退的最常見原因。研究證實(shí)，妊娠期甲狀腺功能減退對(duì)子女的神經(jīng)認(rèn)知功能發(fā)育產(chǎn)生不良影響[7]。也有文獻(xiàn)認(rèn)為，單純自身免疫性甲狀腺抗體陽性可能直接導(dǎo)致后代認(rèn)知功能損害[8]，但目前仍存在爭議。因此，孕前及孕期對(duì)甲狀腺相關(guān)指標(biāo)如甲狀腺功能、自身免疫性甲狀腺抗體包括TPOAb的篩查和防治是當(dāng)前優(yōu)生優(yōu)育領(lǐng)域的熱門課題。本項(xiàng)研究通過建立TAI動(dòng)物模型探討孕前TAI對(duì)后代認(rèn)知功能的影響，進(jìn)一步分析孕前篩查TPOAb的意義。

該研究通過pTg免疫SD雌鼠，建立了孕前TAI的動(dòng)物模型。學(xué)習(xí)記憶是神經(jīng)認(rèn)知功能的重要部分。MWM是一種經(jīng)典的行為實(shí)驗(yàn)方法，可以很好地評(píng)估嚙齒動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果顯示，TAI組后代在目標(biāo)象限停留時(shí)間和跨越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低，這表明孕前TAI可能會(huì)導(dǎo)致后代學(xué)習(xí)記憶障礙。眾所周知，海馬體在學(xué)習(xí)記憶中起著重要的作用，其中CA1區(qū)是關(guān)鍵區(qū)域，海馬體發(fā)育障礙可導(dǎo)致人類認(rèn)知功能的損害。因此，本研究從海馬神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)量和功能等方面對(duì)后代海馬CA1區(qū)進(jìn)行了初步探索。NeuN是神經(jīng)元成熟的重要標(biāo)志，其陽性表達(dá)量與神經(jīng)元的功能狀態(tài)密切相關(guān)。突觸是神經(jīng)元信息傳遞、加工和儲(chǔ)存的重要組織，SYN蛋白的表達(dá)影響突觸小泡的運(yùn)輸能力，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。本研究通過HE染色和尼氏染色發(fā)現(xiàn)仔鼠海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有顯著差異。但與對(duì)照組相比，TAI組海馬CA1區(qū)NeuN和SYN陽性細(xì)胞的表達(dá)降低。

以上數(shù)據(jù)表明，孕前TAI對(duì)后代認(rèn)知功能及海馬發(fā)育會(huì)產(chǎn)生不良影響，但具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。甲狀腺激素是調(diào)控腦發(fā)育的關(guān)鍵性激素，對(duì)胎兒腦發(fā)育過程中神經(jīng)元的成熟、突觸的形成及功能等起著重要的作用。TAI與甲狀腺功能異常的發(fā)生密切相關(guān)，TPOAb是反映TAI的特異性指標(biāo)，參與甲狀腺細(xì)胞的損傷，是甲狀腺功能減退的危險(xiǎn)因素。且隨著妊娠進(jìn)展，孕婦和胎兒對(duì)甲狀腺激素需求增加，TPOAb陽性的母體自身促甲狀腺激素（TSH）水平會(huì)逐漸增高，最終可出現(xiàn)亞甲減甚至甲減[9]。因此我們推測(cè)，孕前TAI對(duì)后代認(rèn)知功能及海馬神經(jīng)元發(fā)育的損害，其機(jī)制可能與TAI導(dǎo)致母體甲狀腺激素異常有關(guān)。也有一些研究認(rèn)為，自身免疫性甲狀腺抗體陽性的母體，即使甲狀腺功能正常，也會(huì)導(dǎo)致后代認(rèn)知發(fā)育障礙，可能與以下三方面機(jī)制有關(guān)：妊娠期自身免疫性甲狀腺抗體陽性是產(chǎn)后甲狀腺炎的主要原因，與產(chǎn)后抑郁有一定的關(guān)聯(lián)[10]，可能會(huì)對(duì)后代認(rèn)知發(fā)育產(chǎn)生不良影響；TPOAb能通過胎盤，可導(dǎo)致胎兒短暫性TSH水平升高，胎兒自身甲狀腺激素不足而影響胎兒腦發(fā)育[11]；妊娠期TPOAb陽性的母親，其后代感覺性神經(jīng)性聽力缺陷的發(fā)病率明顯升高，可能對(duì)認(rèn)知發(fā)育產(chǎn)生不良影響[12]。但目前甲狀腺功能正常的TAI對(duì)后代發(fā)育的影響尚存在爭議。這項(xiàng)研究也存在一些局限性，未來對(duì)于孕前TAI對(duì)后代認(rèn)知功能影響及機(jī)制的深入研究，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：首先，母體孕前及妊娠過程中自身免疫性甲狀腺抗體陽性的滴度和甲狀腺激素水平對(duì)后代認(rèn)知功能的發(fā)育可能很重要，應(yīng)控制更嚴(yán)格的條件，如分離自身免疫性甲狀腺抗體、控制甲狀腺激素正常水平等。其次，為了更全面地評(píng)價(jià)后代的認(rèn)知功能，應(yīng)開展避暗測(cè)試、恐懼條件反射測(cè)試等多項(xiàng)行為實(shí)驗(yàn)，以及后代遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的測(cè)試。

綜上所述，孕前TAI對(duì)仔鼠認(rèn)知功能會(huì)產(chǎn)生不良影響，建議孕前篩查自身免疫性甲狀腺抗體，這與2019年我國《妊娠和產(chǎn)后甲狀腺疾病診治指南》第2版意見一致，且該指南指出對(duì)于孕前甲狀腺功能正常而TPOAb或TgAb陽性的婦女在妊娠后,應(yīng)注意監(jiān)測(cè)血清TSH水平,推薦每4周檢測(cè)一次至妊娠中期末[2]。對(duì)于育齡期女性盡早發(fā)現(xiàn)甲狀腺相關(guān)疾病并給予適當(dāng)?shù)闹委?，?duì)改善妊娠結(jié)局及避免對(duì)后代的不良影響具有重要意義。