范嗣剛，劉 勇,2，趙 超，侯思禹，邱麗華,2,

日本囊對(duì)蝦核因子κB抑制蛋白激酶ε2基因克隆及表達(dá)

范嗣剛1，劉 勇1,2，趙 超1，侯思禹3，邱麗華1,2,3

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

【目的】了解核因子κB抑制蛋白激酶ε2（IKKε2）基因在日本囊對(duì)蝦（）受細(xì)菌刺激后的應(yīng)答情況，以闡釋在對(duì)蝦先天免疫中所起的作用?！痉椒ā繌娜毡灸覍?duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得日本囊對(duì)蝦（命名為）的cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用熒光定量PCR分析的組織表達(dá)以及受哈維弧菌（）刺激后在肝胰腺組織的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】全長(zhǎng)為4 009 bp，其中開放閱讀框長(zhǎng)2 337 bp，編碼778個(gè)氨基酸，5′UTR（Untranslated region）174 bp，3′UTR 1 498 bp。PjIKKε蛋白含有一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)類泛素結(jié)構(gòu)域和一個(gè)TANK結(jié)合激酶卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，PjIKKε2蛋白序列與其他甲殼類IKKε的相似性高，在激酶結(jié)構(gòu)域保守性高。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，PjIKKε2與其他對(duì)蝦屬的IKKε聚集在一支。在日本囊對(duì)蝦9個(gè)組織中均有表達(dá)，在淋巴組織中表達(dá)量最高（< 0.05）。在哈維弧菌刺激6 h后，在肝胰腺中表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到最大值（< 0.05）。【結(jié)論】PjIKKε2參與了日本囊對(duì)蝦的先天免疫。

日本囊對(duì)蝦；核因子κB抑制蛋白激酶ε2；基因表達(dá)；先天免疫

先天免疫是機(jī)體抵御病原體侵犯的第一道防線[1]，依賴于核因子κB（Nuclear factor Kappa-B，NF-κB）和干擾素調(diào)控因子（interferon regulatory factor，IRF)）等轉(zhuǎn)錄因子的激活。核因子κB抑制蛋白激酶 [inhibitor of κB kinase (IKK)] 家族能激活NF-kB信號(hào)途徑[2]。該途徑與I型干擾素、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子共同作用，消除細(xì)菌和病毒的入侵[3-4]。因此，IKK/NF-κB是動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)中一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已廣受關(guān)注[2,5-6]。

在哺乳動(dòng)物中，IKK家族成員分為經(jīng)典的IKK（IKKα、IKKβ）和非經(jīng)典的IKK（IKKε和TANK結(jié)合激酶）[7]。IKKε有IKKε1和IKKε2兩種。IKKε主要在胰腺、胸腺和脾臟中表達(dá)，在T細(xì)胞中也有表達(dá)。然而，許多細(xì)胞在佛波酯、脂多糖、病毒RNA等微生物產(chǎn)物和TNF、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，IKKε表達(dá)量快速上調(diào)[9]。IKKε通過激活體內(nèi)NF-κB、IRF3等轉(zhuǎn)錄因子，使IκB α、IFN-α和IFN-β蛋白磷酸化[10-11]，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)。當(dāng)病毒入侵時(shí)，IKKε能使IRF3和IRF7磷酸化，也能使IκBa、IKKb、NF-κB亞基p65等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而激活NF-κB[10-11]。

日本囊對(duì)蝦（）又稱花蝦、九節(jié)蝦，屬亞熱帶種類，主要分布在日本、朝鮮沿海，非洲東海岸，印度-西太平洋熱帶，中國東南沿海等地[12]，是我國對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要物種之一，有生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、食性雜、耐低氧等特點(diǎn)[12]。目前，已有日本囊對(duì)蝦先天免疫研究[13-14]，IKKε在甲殼類亦有少量研究[5,15-16]。在斑節(jié)對(duì)蝦（）中，IKKε2和IKKε1均參與先天免疫過程，可能在細(xì)胞因子系統(tǒng)和信號(hào)傳導(dǎo)交互作用中起正向作用[5]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦（）IKKε通過激活NF-kB 信號(hào)途徑激活A(yù)MP表達(dá)，抵御白斑綜合征病毒（WSSV）感染[15]。Jiang等[16]獲得擬穴青蟹（）的、基因，發(fā)現(xiàn)在注射溶藻弧菌（）或poly (I:C)后，表達(dá)量顯著增多。而IKKε是否參與日本囊對(duì)蝦的先天免疫，未見報(bào)道。本研究獲得日本囊對(duì)蝦基因序列，研究哈維弧菌刺激后在肝胰腺的表達(dá)情況，為探究該基因在日本囊對(duì)蝦先天免疫中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

體質(zhì)量（21.3 ± 2.0）g的日本囊對(duì)蝦，購自湛江某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)。剖取對(duì)蝦肝胰腺、肌肉、淋巴鰓、神經(jīng)節(jié)、胃、心、血淋巴、眼柄等組織，液氮冷凍后保存，用于克隆和組織表達(dá)分析。

隨機(jī)選取400尾健康有活力體質(zhì)量（30 ± 2）g的日本囊對(duì)蝦，在鹽度35、水溫（25 ± 1）℃水池中暫養(yǎng)3 d，用于菌液注射實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)殖期間，每天換水2/3，及時(shí)清除池內(nèi)的殘留物，投喂對(duì)蝦飼料。

1.2 細(xì)菌刺激實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2組，每組3個(gè)平行組，即每組設(shè)3桶（水體為1 000 L），每桶50尾蝦。實(shí)驗(yàn)組每桶中的每尾蝦腹腔注射50 μL 1 × 106cfu?mL-1哈維弧菌懸液，對(duì)照組每尾蝦腹腔注射50 μL磷酸鹽緩沖液（PBS, 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4）。在注射后0、6、12、24、48、72 h分別取蝦5尾，剖取肝胰腺，液氮冷凍后移至– 80℃冰箱中保存。

1.3 RNA提取和cDNA合成

用Tirzol（Invitrogen，美國）提取上述樣品的RNA。用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分別檢測(cè)RNA完整性和濃度。

用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成肌肉組織cDNA的第一條鏈。用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，日本）試劑盒，以IKKε cDNA序列為模板，以O(shè)ligo-dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到IKKε的cDNA鏈，用于實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。

1.4 日本囊對(duì)蝦IKKε基因克隆和測(cè)序

從日本囊對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRX2030618）中獲得基因cDNA序列。用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物-S1和-A1（表1）。PCR反應(yīng)體系為20 μL，含13.8 μL ddH2O，2.0 μL 10×PCR Ex Buffer（Mg2+Plus），1.6 μL dNTP（各2.5 mmol/L），0.8 μL正/反向引物（10 mmol/L），0.8 μL cDNA模板，0.2 μL ExTaq（5 U/μL）（TaKaRa，日本）。反應(yīng)程序：94℃，3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。用膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]回收PCR產(chǎn)物，在16 ℃條件下將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMDTM18-T（TaKaRa）載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。通過菌液PCR篩選出陽性克隆，送至廣州擎科生物公司（廣州）測(cè)序。

表1 引物序列

1.5 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/）查找開放閱讀框和預(yù)測(cè)編碼蛋白序列；用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)編碼蛋白理化特性；用Global Align軟件分析蛋白相似性。用Conserved domains軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白結(jié)構(gòu)；預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)用NetNGIys 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）；用軟件SignalP5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/) 預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；用Clustal X進(jìn)行序列多重比對(duì)；用MEGA 7.0[17]的鄰接（Neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap置信值為1 000。

1.6 組織表達(dá)分析

用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)（Takara，日本）將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，每種組織cDNA設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并稀釋至50 ng/μL，備用。用引物qIKKε-S和qIKKε-A（表1）進(jìn)行熒光定量PCR，以日本囊對(duì)蝦為內(nèi)參基因。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書配制反應(yīng)體系并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行溶解曲線反應(yīng)，以檢測(cè)擴(kuò)增特異性。每種組織cDNA和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)平行。用2-ΔΔCt法[18]計(jì)算的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)< 0.05時(shí)差異顯著，< 0.01時(shí)差異極顯著，用Excel 2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 IKKε的克隆與鑒定分析

獲得日本囊對(duì)蝦基因，命名為（GenBank號(hào)MZ707249）。cDNA全長(zhǎng)4009 bp，其中開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)2337 bp，編碼778個(gè)氨基酸，5非編碼區(qū)長(zhǎng)174 bp，3UTR長(zhǎng)1498 bp。PjIKKε2蛋白理論分子質(zhì)量為88.076 ku，理論等電點(diǎn)pI為6.07。PjIKKε2蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，含有一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域（第18－331位氨基酸）、一個(gè)類泛素結(jié)構(gòu)域（第310－388位氨基酸），一個(gè)TANK結(jié)合激酶卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（第407–670位氨基酸）。Global Align分析顯示，PjIKKε2蛋白序列與甲殼類IKKε的相似性均高于80%。PjIKKε2與PvIKKε2的相似性最高（89%），與HsIKKε的最低（27%）（表2）。氨基酸序列（圖2）多重比對(duì)結(jié)果表明，IKKε2蛋白在激酶結(jié)構(gòu)域中保守性較高，有140個(gè)完全保守的氨基酸（用‘‘*”標(biāo)記），89個(gè)相對(duì)保守的氨基酸（用‘‘:”和‘‘.”標(biāo)記），保守率高達(dá)70.68%。

PK為激酶結(jié)構(gòu)域；Ubl_TBK1_like為類泛素結(jié)構(gòu)域；TBK1_CCD1為TANK結(jié)合激酶卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域

表2 用于多重序列比對(duì)的IKKε蛋白及其與PjIKKε2的相似性

下劃直線為激酶結(jié)構(gòu)域，“*”, “:”和“.” 分別表示完全保守，保守性強(qiáng)和保守性弱的位點(diǎn)

圖3顯示，無脊椎動(dòng)物（甲殼動(dòng)物、昆蟲和海鞘）與脊椎動(dòng)物各聚為一支，PjIKKε2與其他對(duì)蝦屬的IKKε聚集在一支。斑節(jié)對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦的IKKβ氨基酸序列為外群。

2.2 PjIKKε2的組織表達(dá)

在日本囊對(duì)蝦9個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在淋巴組織中表達(dá)量最高（0.05），其次是在神經(jīng)節(jié)和眼柄，在肝胰腺、肌肉、胃和心臟的表達(dá)量最低，差異不顯著（圖4）

2.3 哈維弧菌刺激后PjIKKε2的表達(dá)情況

注射哈維弧菌6 h后，在肝胰腺中的表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到最大值 (< 0.05)，隨后逐漸減弱并持續(xù)至72 h，48 h后恢復(fù)正常水平，在6、12和24 h，mRNA的表達(dá)量與0 h時(shí)有顯著差異 (< 0.05)（圖5）。

圖3 基于IKKε氨基酸序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

不同字母表示差異顯著（P < 0.05）。Hep，肝胰腺；M，肌肉；L，淋巴；Gi，鰓；Ga，神經(jīng)節(jié)；S，胃；Hea，心；Hem，血淋巴；E，眼柄

不同字母表示有顯著差異（P < 0.05）

3 討論

本研究獲得日本囊對(duì)蝦基因的cDNA全長(zhǎng)序列，其中ORF長(zhǎng)2 337 bp，編碼778個(gè)氨基酸，含有一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)類泛素結(jié)構(gòu)域，一個(gè)TANK結(jié)合激酶卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。斑節(jié)對(duì)蝦基因編碼710個(gè)氨基酸，凡納濱對(duì)蝦基因編碼704個(gè)氨基酸，均比的氨基酸序列短。PjIKKε2氨基酸的C端序列比斑節(jié)對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦IKKε2氨基酸C端多70多個(gè)氨基酸。這段多出的序列功能需進(jìn)一步研究。同時(shí)，這3種對(duì)蝦IKKε2蛋白序列均含有激酶結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)結(jié)果顯示，激酶結(jié)構(gòu)域在各物種中高度保守。激酶結(jié)構(gòu)域的功能是催化gamma-磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。另外，在日本囊對(duì)蝦PjIKKε2中有類泛素結(jié)構(gòu)域，這與Verhelst等[2]的報(bào)道一致。類泛素結(jié)構(gòu)域能優(yōu)化激酶活性[8]。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，PjIKKε與其他對(duì)蝦IKKε聚為一支，與物種分類結(jié)果一致。

研究證明，IKKε主要在哺乳動(dòng)物的胰腺、胸腺、脾臟等免疫相關(guān)組織和T細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和星形狀膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)[2,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在日本囊對(duì)蝦9個(gè)組織中均有表達(dá)。在其他甲殼動(dòng)物中，在各組織中均有表達(dá)[5,15-16]，這可能說明在低等動(dòng)物中，基因功能更加廣泛，在許多組織中均有作用。在淋巴組織中表達(dá)量最高。淋巴中有免疫因子，是對(duì)蝦主要的免疫組織[20]。這也說明的功能保守性，即主要在先天免疫中起作用。另外，在神經(jīng)節(jié)的表達(dá)量高，這與凡納濱對(duì)蝦的研究結(jié)果[15]相似。M?ser等[21]發(fā)現(xiàn)，IKKε通過激活NF-κB參與小鼠的神經(jīng)性疼痛。IKKε在對(duì)蝦神經(jīng)中的作用，還需進(jìn)一步研究。

先天免疫是對(duì)蝦抵御外界病原體的第一道防線[20]。在機(jī)體感染病原后，宿主的模式識(shí)別受體能識(shí)別病原體的配體，從而引起一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過IKK復(fù)合物產(chǎn)生抗菌肽[22]。在脊椎動(dòng)物中，IKKε及IKK相關(guān)的激酶能使IRF-3和IRF-7磷酸化，從而激活宿主的抗細(xì)菌反應(yīng)[23]。本研究中，注射哈維弧菌6 h后，在肝胰腺中的表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到最大值。在斑節(jié)對(duì)蝦注射哈維弧菌后，在血細(xì)胞的表達(dá)量在注射6 h時(shí)降低，在12 h時(shí)升至注射前，隨后逐漸降低[14]。在凡納濱對(duì)蝦中，注射溶藻弧菌6 h后，在肝胰腺的表達(dá)量上升，是0 h表達(dá)量的1.5倍，在24 h達(dá)到最大值（是0 h表達(dá)量的2倍）[15]。擬穴青蟹在注射溶藻弧菌6 h后，在肝胰腺的表達(dá)量達(dá)到最大值，隨后逐漸下降，在72 h時(shí)略有升高[16]。這些結(jié)果均說明甲殼類的參與了細(xì)菌引起的先天免疫應(yīng)答過程。

綜上，本研究克隆出基因cDNA全長(zhǎng)，在哈維弧菌刺激下，mRNA表達(dá)表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的變化，表明基因參與了日本囊對(duì)蝦的先天免疫。這為研究IKKε2的免疫功能提供了理論依據(jù)，也為研究甲殼類動(dòng)物的先天免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。

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Characterization and Expression of Inhibitor-κB Kinase Epsilon 2 in

FAN Si-gang1, LIU Yong1,2，ZHAO Chao1, HOU Si-yu3, QIU Li-hua1,2,3

（1.;,;,,510300,;2.,201306,; 3.,,300384,）

【Objective】In order to investigate inhibitor κB kinase epsilon 2 (IKKε2) response of bacterial infection and elucidate the function of IKKε2 ininnate immunity.【Method】The full-length cDNA of(named) was identified and characterized with bioinformatics strategy.The expression ofwas detected in various tissues under normal condition and in hepatopancreas after the treatment with.【Result】PjIKKε2 cDNA was 4 009 bp length, including a 2 337 bp open reading frame (ORF) encoding 778 amino acid, a 174 bp 5′untranslated region (5′-UTR) and a 1 498 bp 3′-UTR.PjIKKε2 protien contain an N-terminal catalytic kinase domain, an ubiquitin-like domain and a TANK-binding kinase 1 coiled-coil domain.Multiple sequence alignment showed that PjIKKε2 share high identity with that of another IKKε2 of crustacean.The kinase domain was conserved in most species.The phylogenetic analysis suggested that PjIKKε2 was clustered with the closely related IKKs fromand.transcript was detected in all examined tissues with high mRNA expression in lymph.Following the infection of, thewas up-regulated significantly in hepatopancreas (< 0.05) and maximize at 6 h.【Conclusion】PjIKKε2 plays an important role in innate immunity of.

; inhibitor κB kinase epsilon 2; gene expression; innate immunity

S917.4; Q786

A

1673-9159（2022）02-0013-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.002

2021-10-09

國家自然科學(xué)基金（31802281）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021B0202020002）；中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) (2020TD21) ；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202102020487）；廣州市農(nóng)村科技特派員項(xiàng)目（20212100051）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2021TS03；2021SD11)

范嗣剛（1982―），男，博士，副研究員，從事海洋生物功能基因研究。E-mail: fansigang@scsfri.ac.cn

邱麗華（1971―），女，博士，研究員，從事海洋生物功能基因研究。E-mail: qiugroup_bio@outlook.com

范嗣剛，劉勇，趙超，等.日本囊對(duì)蝦核因子κB抑制蛋白激酶ε2基因克隆及表達(dá)[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（2）：13-19.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）