李 洋，布比阿加爾·哈依拉提，秦亞迪，姚 軍△，袁 潔，游 林

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆第二醫(yī)學(xué)院，新疆 克拉瑪依 834000；3.和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司，新疆 和田 848000）

肉蓯蓉又名蓯蓉、地精，屬列當(dāng)科肉蓯蓉屬，以干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖入藥［1］，寄生于藜科植物梭梭和檉柳的根部，在我國主要分布于內(nèi)蒙古、青海、新疆、寧夏等西北干旱地區(qū)［2］。其最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［3］，味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經(jīng)，因具有補腎壯陽、潤腸通便、保肝、抗衰老、抗疲勞、增強免疫力等功效，臨床多用于治療腎陽虛衰、血枯便秘、女子不孕、腰膝痿軟、記憶力減退等癥狀［4-7］，素有“沙漠人參”和“藥中珍品”之美稱［8］。肉蓯蓉屬植物主要含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、木質(zhì)素類等成分［9-10］，以毛蕊花糖苷和松果菊苷為代表的苯乙醇苷類成分具有壯陽、抗衰老、抗氧化、增強記憶力等功效［11-15］，是肉蓯蓉屬植物的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也是2020年版《中國藥典（一部）》肉蓯蓉項下質(zhì)量評價和控制的指標性成分。有研究報道了高效液相色譜（HPLC）法測定肉蓯蓉屬植物苯乙醇苷類成分的含量，但僅限于肉蓯蓉藥材及飲片［16-17］。目前，關(guān)于管花肉蓯蓉提取物尚無國家標準，對其進行含量測定也未見報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新疆管花肉蓯蓉主要含有松果菊苷、異毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、管花苷A這4種代表性苯乙醇苷類成分。本研究中建立了同時測定肉蓯蓉飲片及管花肉蓯蓉提取物中4種上述成分含量的HPLC法，旨在為更好地評價肉蓯蓉飲片及制訂其提取物的質(zhì)量標準提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；AB135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；艾柯超純水儀系統(tǒng)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

松果菊苷對照品（批號為S-003-01904003）、異毛蕊花糖苷對照品（批號為Y-073-11803024）、毛蕊花糖苷對照品（批號為M-011-02103019）、管花苷A對照品（批號為G-066-11812016），均購于北京英萊克科技發(fā)展有限公司，含量均大于98%；乙腈、甲醇均為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。4批肉蓯蓉飲片（編號S1，S2，荒漠肉蓯蓉，產(chǎn)地內(nèi)蒙古；編號S3，S4，管花肉蓯蓉，產(chǎn)地新疆），均購于烏魯木齊的4家藥店；管花肉蓯蓉提取物（編號S5，滅酶干片水提；編號S6，滅酶干片醇提；編號S7，滅酶干片醇提上樹脂），均購自新疆和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～12 min時17%A→20%A，12～30 min時20%A→22%A，30～35 min時22%A→17%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：稱取4種對照品各適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容，制成松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為1.008，1.011，012，1.012 mg/mL的單一對照品貯備液。量取適量，置同一10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，制成松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為201.60，50.55，101.20，50.60μg/mL的混合對照品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

供試品溶液：取肉蓯蓉飲片粉末（過4號篩）約1.0 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率35 kHz）提取40 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得肉蓯蓉飲片供試品溶液。取管花肉蓯蓉提取物粉末約0.2 g，精密稱定，同法制備管花肉蓯蓉提取物供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2項下3種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按松果菊苷峰計應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Echinacoside 2.Tubuloside A 3.Acteoside 4.Isoacteoside A.Mixed reference solution B.Test solution of Cistanches Herba decoction pieces C.Test solution of Cistanche Tubulosa extractFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密量取10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表1。

檢測限與定量限考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比為3∶1和10∶1時的質(zhì)量濃度分別作為檢測限和定量限。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系及檢測限與定量限考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，L O D and LOQ

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.31%，0.91%，1.58%，0.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.84%，2.18%，1.05%，1.55%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：稱取樣品（編號S2）粉末適量，精密稱定，平行6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的平均含量分別為0.779%，0.020%，0.155%，0.074%，R S D分別為1.21%，3.12%，2.65%，2.96%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（編號S2）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的單一對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取各批樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.3 Results of content determination of four phenylethanol gly?cosides in the samples（%，n=3）

3 討論

本研究中采用二極管陣列檢測器，在200～450 nm波長范圍內(nèi)對混合對照品溶液和供試品溶液的待測成分進行掃描，結(jié)果松果菊苷、毛蕊花糖苷在330 nm，管花苷A在331 nm，異毛蕊花糖苷在327 nm波長處有最大吸收。同時，參考2020年版《中國藥典（一部）》肉蓯蓉項下松果菊苷和毛蕊花糖苷的檢測波長330 nm，各成分在330 nm波長處的色譜峰較多，響應(yīng)值較高，故確定最終測定波長為330 nm。

從肉蓯蓉飲片含量測定結(jié)果來看，管花肉蓯蓉和荒漠肉蓯蓉中松果菊苷的含量最高，其次為毛蕊花糖苷，管花苷A和異毛蕊花糖苷的含量相對較低。4種苯乙醇苷類成分含量差異較大，且不同產(chǎn)地、同一產(chǎn)地不同批間有效成分含量差異也較大，這與藥材不同產(chǎn)地的地理環(huán)境、溫度、氣候及采收加工等因素有關(guān)，影響了植物中化學(xué)成分的積累。不同基源肉蓯蓉的化學(xué)成分種類相似，但各類成分含量不同，導(dǎo)致其功效各有側(cè)重，故應(yīng)根據(jù)功效選擇合適的基源藥材，以達到更好的臨床效果。

綜上所述，本研究中建立的方法簡便快捷、準確有效，可用于同時測定肉蓯蓉飲片及管花肉蓯蓉提取物中4種苯乙醇苷類成分。樣品含量測定結(jié)果可反映不同產(chǎn)地、同一產(chǎn)地不同批次的肉蓯蓉飲片及管花肉蓯蓉不同提取物的質(zhì)量水平，為制訂相關(guān)質(zhì)量標準提供了理論依據(jù)。