杜昊忱，劉 侃，袁曉梅，張 微，關(guān)永霞，張貴民

（1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006）

脈絡(luò)舒通丸主要由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、玄參、當(dāng)歸、白芍、甘草、水蛭、蜈蚣、全蝎12味藥材組方，有清熱解毒、化瘀通絡(luò)、祛濕消腫功效，用于治療濕熱瘀阻脈絡(luò)所致血栓性淺靜脈炎，以及非急性期深靜脈血栓形成所致下肢腫脹、疼痛、膚色暗紅或伴有條索狀物［1］。臨床研究表明，脈絡(luò)疏通丸治療血小板減少癥、急性下肢靜脈血栓、濕熱壅滯型混合痔術(shù)后水腫等有顯著療效［2-5］。水蒸氣蒸餾法是中藥揮發(fā)油提取的常用方法，簡單易操作，可避免有機(jī)溶劑污染，綠色環(huán)保，適合工業(yè)化大生產(chǎn)［6-8］?？刂茡]發(fā)油的質(zhì)量（穩(wěn)定均一）是其發(fā)揮療效的關(guān)鍵［9］。揮發(fā)油出油率不僅受藥材飲片外觀性狀、成分種類及主要成分含量影響，更受液料比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間等提取工藝因素影響［10-12］。故本研究中采用水蒸氣蒸餾法提取藥材中當(dāng)歸、白芍、玄參、金銀花、蒼術(shù)5味揮發(fā)性成分，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選其最佳提取工藝，并采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分析和鑒定，為中藥揮發(fā)油的開發(fā)及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo TRACE 1310-IQS型氣相色譜質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）；XS204型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Agilent-G9-UV型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；JY-15型超聲波清洗機(jī)（鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司）。

1.2 試藥

白芍藥材（安徽人民中藥飲片有限公司，批號(hào)為190601），蒼術(shù)藥材（安國市宇通藥材有限公司，批號(hào)為190626），當(dāng)歸藥材（山東民瑞中藥飲片有限公司，批號(hào)為5191003），玄參藥材（隴西千金藥材有限公司，批號(hào)為W006-1908059），金銀花藥材（山東民瑞中藥飲片有限公司，批號(hào)為5190810），均經(jīng)中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)試驗(yàn)室范建偉高級(jí)工程師鑒定為正品；綠原酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110753-201716，含量為96.8%）；高效液相色譜用試劑均為色譜純，分析用試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Thermo HP-5 MS石英毛細(xì)管色譜柱（30.0 m×0.25 mm，1.0μm）；程序升溫：初始溫度為60℃并保持3 min，以4℃/min的速率升至200℃并保持5 min，以10℃/min的速率升至280℃；進(jìn)樣口溫度：280℃；分流比：20∶1；進(jìn)樣量：0.5μL；載氣：氦氣（≥99.999%）；流速：1.0 mL/min。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊（EI）離子源，電子能源70 eV，傳輸線溫度為280℃，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃；全掃描檢測方式，掃描范圍為40～650 amu。

2.1.3 檢測方法

按脈絡(luò)舒通丸0.4倍處方量稱取蒼術(shù)、當(dāng)歸、白芍各166.8 g，玄參、金銀花各333.2 g，置圓底燒瓶中，加水適量，浸泡，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，置電熱套中加熱至沸騰，并保持微沸，收集揮發(fā)油，測定揮發(fā)油提取量，并對(duì)揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜圖中15種主要成分（相對(duì)含量＞0.7%）進(jìn)行鑒別。結(jié)果見圖1和表1。

表1 脈絡(luò)疏通丸揮發(fā)油化學(xué)成分氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of chemical components of volatile oil in Mailuo Shutong Pills by GS-MS

圖1 脈絡(luò)疏通丸揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜圖Fig.1 GS-MS chrotograms of volatile oil in Mailuo Shutong Pills

2.2 綠原酸提取率

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取綠原酸對(duì)照品25 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為250μg/mL的溶液，即得對(duì)照品貯備液；精密吸取10 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取2.1.3項(xiàng)下提取揮發(fā)油殘液1 mL，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，密塞，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)不低于15 000，分離度均大于2。詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.Chlorogenic acid A.Reference solution B.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密移取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0，1.00，2.50，5.00，7.50，10.00 mL，分別置25 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0，10.00，25.00，50.00，75.00，100.0μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、綠原酸質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=16.778 52C+8.329 96（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在0～100.00μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限確定：精密吸取對(duì)照品溶液適量，分別以稀釋至信噪比（S/N）為1∶3和1∶10時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測限和定量限，結(jié)果兩者分別為0.035 59μg/mL和0.118 6μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果的R SD為3.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，室溫下分別于0，2，4，6，12，24，48 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的R S D為2.85%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品溶液6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的R SD為3.22%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別取已知綠原酸含量的提取液6份，分別按低、中、高濃度比例加入綠原酸對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 測定方法

量取揮發(fā)油提取殘液，測定綠原酸含量，計(jì)算綠原酸提取率。綠原酸提取率（%）=［提取殘液中綠原酸含量（mg/mL）×提取殘液體積（mL）］/［藥材中綠原酸含量（mg/g）×藥材質(zhì)量（g）］×100%。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考2020年版《中國藥典（一部）》中脈絡(luò)疏通丸項(xiàng)下方法，分別以浸泡時(shí)間（因素A）、加水量（因素B）、提取時(shí)間（因素C）為考察因素，以揮發(fā)油提取量、綠原酸提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選當(dāng)歸、白芍、玄參、金銀花、蒼術(shù)5味藥材的揮發(fā)油提取工藝。因素水平見表3。

表3 因素水平表Tab.3 The factor levels

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5和表6。由表4和表5可見，因素A、因素B、因素C對(duì)揮發(fā)油的提取量均無顯著影響（P＞0.05），各因素對(duì)揮發(fā)油提取的影響強(qiáng)度為C＞B＞A，最佳工藝條件為A1（或A2或A3）B3C3。由表4和表6可見，因素A、因素B、因素C對(duì)綠原酸提取率均無顯著影響（P＞0.05），各因素對(duì)綠原酸提取率的影響強(qiáng)度為B＞A＞C，最佳工藝條件為A1B3C1。綜合考慮，最佳提取工藝為A1B3C2，即不浸泡，加10倍量水，提取6 h。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.4 Results of the L9（34）orthogonal test（n=9）

表5 揮發(fā)油方差分析結(jié)果Tab.5 ANOVA results of volatile oil

表6 綠原酸提取率方差分析結(jié)果Tab.6 ANOVA results of the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)所得最佳提取工藝，重復(fù)提取揮發(fā)油3次，測量揮發(fā)油提取量，計(jì)算綠原酸提取率。結(jié)果見表7?？梢?，在最佳提取工藝條件下，揮發(fā)油提取量及綠原酸提取率均穩(wěn)定，表明優(yōu)選的提取工藝可靠。

表7 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3）Tab.7 Validation test of the extraction process（n=3）

3 討論

揮發(fā)油是許多中藥材的有效成分，除有解熱、抗菌、抗炎等功效外，還可改善心血管功能、提高機(jī)體免疫力、調(diào)血脂等［13］。目前，艷山姜、高良姜、當(dāng)歸、川芎、肉桂等中藥揮發(fā)油治療心血管系統(tǒng)疾病受到了廣泛關(guān)注［14］。目前揮發(fā)油的提取方法有蒸餾法、浸泡法、壓榨法、溶劑法等傳統(tǒng)方法，以及微波提取、超聲提取等新技術(shù)［15-16］。在微波、超聲波、微波-超聲波和常規(guī)加氫蒸餾法提取非洲三葉草揮發(fā)油、茉莉的技術(shù)中，微波超聲法提取率最高［17-18］。實(shí)際生產(chǎn)中，水蒸氣蒸餾法因簡單、易操作、綠色環(huán)保而成為大生產(chǎn)中揮發(fā)油提取最常用方法，但所得揮發(fā)油成分往往較復(fù)雜［19］?；厝鹑A等［20］采用水蒸氣蒸餾法提取6 h后，川椒組分?jǐn)?shù)和提取率下降，說明提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取效果有較大影響。

中藥揮發(fā)油提取工藝是中藥提取的重要步驟，對(duì)藥物的療效起關(guān)鍵作用。以往的研究中，多數(shù)僅關(guān)注揮發(fā)油提取率，而忽略了殘液中的有效成分［21］。本研究中選用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)揮發(fā)油提取工藝，并采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選出最佳提取工藝，可為大生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供參考。通過GC-MS法對(duì)提取的脈絡(luò)疏通丸揮發(fā)油進(jìn)行分析，鑒定出其中15種化合物，占揮發(fā)油總量的76.96%。揮發(fā)油中多數(shù)成分為單萜、倍半萜等萜類化合物，含量最高的為Z-藁本內(nèi)酯，其次為蒼術(shù)素（8.28%）和α-蒎烯（7.94%）。含量在1%以上的化合物有10種，查閱文獻(xiàn)［22-24］，發(fā)現(xiàn)萜類化合物主要來源于當(dāng)歸和蒼術(shù)。當(dāng)歸揮發(fā)油成分中Z-藁本內(nèi)酯含量最高，其次為α-蒎烯、β-羅勒烯，蒼術(shù)揮發(fā)油成分中蒼術(shù)素含量最高，其次為蒼術(shù)酮、α-水芹烯。其中，5-戊基環(huán)己-1，3-二烯是單味藥材提取所得揮發(fā)油中未出現(xiàn)的成分，其可能是在長時(shí)間提取過程中，揮發(fā)性成分發(fā)生了合成、氧化或熱分解等化學(xué)反應(yīng)而形成的，該化合物形成過程和藥理作用還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、效率高，可為工業(yè)化大生產(chǎn)的改良及后續(xù)開發(fā)研究提供參考。