虞晶晶(綜述)，穆 丹，朱慶豐(審校)

(安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院綜合教研室，安徽 安慶 246133)

鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的死亡方式，鐵死亡的發(fā)生往往是由于細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累，還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)的耗竭，最終導(dǎo)致鐵依賴的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)氧化，脂質(zhì)過氧化會破壞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞死亡[1]。癌癥是除了心血管疾病外致死率最高的疾病，癌癥的發(fā)生必定伴隨著原癌基因的活化和抑癌基因的失活[2]。調(diào)控鐵死亡的基因經(jīng)常發(fā)生突變，使得腫瘤對鐵死亡更敏感。腫瘤細(xì)胞中原癌基因的活化會導(dǎo)致ROS的積累，腫瘤細(xì)胞為了抵抗過高的ROS，會提高細(xì)胞的抗氧化能力[3]。如果干預(yù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，很可能會發(fā)生鐵死亡，達(dá)到治療腫瘤的目的[4]。

1 鐵死亡發(fā)現(xiàn)

鐵死亡的第一次發(fā)現(xiàn)是在2003年，當(dāng)時篩選能夠殺傷大鼠肉瘤(rat sarcoma，Ras)突變腫瘤細(xì)胞的小分子藥物時，找到了一種新型的藥物erastin，erastin能夠使細(xì)胞很快死亡，并且這是一種與凋亡、程序性壞死等完全不同的死亡方式。但是當(dāng)時并沒有找到erastin的靶點。隨后在2008年，又發(fā)現(xiàn)了其他藥物RSL3和RSL5也能導(dǎo)致同樣的腫瘤細(xì)胞死亡。最終在2012年，將這種死亡方式命名為鐵死亡，這是一種鐵依賴性的，與凋亡、程序性壞死等完全不同的死亡方式，往往伴隨著脂質(zhì)ROS的積累，并且發(fā)現(xiàn)erastin的靶點是胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體，erastin能抑制胱氨酸攝取，降低細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽的合成[5]。

在2014年，Yang等[6]發(fā)現(xiàn)了另一個重要的調(diào)節(jié)蛋白谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)，GPX4是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生還原性谷胱甘肽抵抗鐵死亡的關(guān)鍵分子。在2017年Doll等[7]鑒定了乙酰輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)在鐵死亡中的重要作用，ACSL4是合成多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，決定了細(xì)胞對鐵死亡的敏感度。隨后在2019年，又發(fā)現(xiàn)了鐵死亡抑制蛋白在抵抗鐵死亡中的作用[8]。近2年又有了很多新的突破性的發(fā)現(xiàn)，2020年，Riegman等[9]發(fā)現(xiàn)鐵死亡可以在細(xì)胞之間傳播(圖1)。最新的研究又發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)，淋巴中的油酸會保護轉(zhuǎn)移的黑色素瘤細(xì)胞免于鐵死亡[10]。鐵死亡的研究進展十分迅速，近年來隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展和成熟，基于全基因組的CRISPR-Cas9篩選對于發(fā)現(xiàn)鐵死亡中的重要基因提供了極大幫助，其他一些關(guān)鍵節(jié)點分子也逐漸被鑒定出來[11]。

圖1 鐵死亡發(fā)現(xiàn)歷程

2 鐵死亡特征

2.1形態(tài)學(xué)特征 細(xì)胞鐵死亡表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂、輕微的染色質(zhì)凝集和細(xì)胞腫脹。與細(xì)胞凋亡、程序性壞死、細(xì)胞自噬不同的是，鐵死亡細(xì)胞在電子顯微鏡下能觀察到線粒體異常，如線粒體凝集或腫脹、膜密度增加、嵴減少或缺失以及線粒體外膜破裂，這些特征已經(jīng)是作為檢測鐵死亡發(fā)生的重要標(biāo)志[5,11]。

2.2生化特征 鐵死亡是一種ROS導(dǎo)致的細(xì)胞死亡方式，有2個重要的標(biāo)志：鐵積累和脂質(zhì)過氧化。細(xì)胞中積累的Fe2+通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生額外的羥基自由基，造成氧化損傷。另外，鐵可以提高脂氧合酶和脯氨酸羥化酶的活性[1]，產(chǎn)生鐵死亡的另一個生化特征：脂質(zhì)過氧化(表1)。

細(xì)胞中的脂肪酸包括飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)、PUFA，其中PUFA是細(xì)胞膜磷脂的重要組成成分，PUFA在ROS的攻擊和脂氧合酶的作用下產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，發(fā)生斷裂和縮短，并釋放一些小的脂肪族產(chǎn)物4-羥基烯醛等，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞死亡。這也是檢測鐵死亡發(fā)生的重要依據(jù)[12]。

表1 鐵死亡與凋亡、程序性壞死和自噬比較

GPX4：谷胱甘肽過氧化物酶4；TFR1：轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1；SLC7A11：溶質(zhì)載體家族7成員11；NRF2：核因子E2相關(guān)因子2；HSPB1：熱休克蛋白β-1；ACSL4：?；o酶A合成酶長鏈家族成員4；FSP1：鐵死亡抑制蛋白1；Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤2；Bax：Bcl-2相關(guān)的x凋亡調(diào)節(jié)因子；RIP1：受體相互作用蛋白1；RIP3：受體相互作用蛋白3；ATG5：自噬相關(guān)蛋白5；ATG7：自噬相關(guān)蛋白7；LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；TFEB：轉(zhuǎn)錄因子EB

3 鐵死亡調(diào)控機制

3.1SystemXc-轉(zhuǎn)運胱氨酸 SystemXc-是一個廣泛分布在磷脂雙分子層膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，主要包含2個亞基SLC7A11和SLC3A2。SystemXc-負(fù)責(zé)將胱氨酸轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞，同時將等量的谷氨酸轉(zhuǎn)運出細(xì)胞。胱氨酸進入細(xì)胞后被還原形成2個半胱氨酸，半胱氨酸是合成還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)的原料，GSH通過谷胱甘肽過氧化物酶降低細(xì)胞內(nèi)的ROS和脂質(zhì)過氧化。抑制SystemXc-的活性會降低胱氨酸吸收和還原性谷胱甘肽合成，最終導(dǎo)致氧化損傷和鐵死亡。經(jīng)典的erastin和索拉非尼能通過抑制SystemXc-來誘導(dǎo)鐵死亡[13]。最近的文獻(xiàn)表明P53蛋白也可以抑制SystemXc-的活性，從而降低細(xì)胞的抗氧化能力，導(dǎo)致細(xì)胞對鐵死亡敏感[14]。

3.2GPX4抑制鐵死亡 在所有的谷胱甘肽過氧化物酶家族中，GPX4在鐵死亡的調(diào)控過程中占據(jù)著最重要的位置，同時也是調(diào)控鐵死亡最關(guān)鍵的一環(huán)。GPX4利用GSH將過氧化的脂質(zhì)還原為相應(yīng)的醇類。抑制GPX4會誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生，如RSL3及相關(guān)的衍生藥物。敲低GPX4或者在GPX4表達(dá)水平較低的細(xì)胞中，對鐵死亡也更加敏感[6]。另外，GPX4是人體中25個硒蛋白之一，GPX4發(fā)揮催化作用需要硒的參與，硒的水平也會影響GPX4的表達(dá)水平[15]。

3.3鐵在鐵死亡中的作用 從鐵死亡的名稱中可看出，鐵死亡的發(fā)生依賴鐵元素。首先，鐵元素可以推動芬頓反應(yīng)的進行，催化過氧化氫產(chǎn)生羥自由基。然后在GPX4受到抑制的情況下，羥自由基攻擊多不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化的脂質(zhì)，過氧化的脂質(zhì)又可以在鐵的催化作用下產(chǎn)生新的自由基，導(dǎo)致鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行，促進脂質(zhì)過氧化的進一步傳播[16]。

在體內(nèi)，小腸吸收和紅細(xì)胞裂解產(chǎn)生的Fe2+首先被銅藍(lán)蛋白氧化為Fe3+，F(xiàn)e3+可以結(jié)合細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白，形成的復(fù)合物又被細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor-1，TFR1)識別并幫助其內(nèi)吞進入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的Fe3+在金屬還原酶家族3的作用下被還原成為Fe2+，F(xiàn)e2+一方面以游離的鐵離子形式構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)的鐵池，另一方面也可以儲存在鐵蛋白中，發(fā)揮廣泛的作用。因此，如果干擾TFR1的表達(dá)，可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)的鐵離子濃度，抑制鐵死亡。然而，血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)催化血紅素降解產(chǎn)生游離的鐵，HO-1的過表達(dá)能夠加速erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。

3.4ROS 細(xì)胞內(nèi)的ROS包括超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)。線粒體在進行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP時，因電子傳遞過程發(fā)生電子滲漏或者通過細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子在超氧化物歧化酶的作用下形成H2O2，H2O2被鐵等金屬元素催化產(chǎn)生羥自由基，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致鐵死亡(圖2)[17]。

在腫瘤細(xì)胞中，由于原癌基因的活化，細(xì)胞會產(chǎn)生ROS。而且腫瘤細(xì)胞快速增殖需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)和能量，細(xì)胞會發(fā)生代謝重編程，線粒體功能異常，也會產(chǎn)生較多的ROS。有研究表明一定程度的ROS能夠傳導(dǎo)增殖信號，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。但是過高的ROS也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此腫瘤細(xì)胞需要提高其抗氧化水平來維持氧化還原平衡。有效地促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡主要包括2種方法：一種方法是增加ROS產(chǎn)生，如一些傳統(tǒng)的化療藥物5-氟尿嘧啶、奧利沙鉑和紫杉醇等。另一種是降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力，如抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗氧化的核因子E2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor E2-related factor 2，NRF2)[4]。

圖2 鐵死亡調(diào)控機制

4 鐵死亡與惡性腫瘤治療

腫瘤抑制因子如p53可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。此外，已經(jīng)有許多FDA批準(zhǔn)的用于腫瘤治療的小分子臨床藥物被發(fā)現(xiàn)能活化鐵死亡，并且在多種腫瘤模型中誘導(dǎo)鐵死亡能夠有效抑制腫瘤增殖。最重要的是發(fā)現(xiàn)鐵死亡可以有效殺傷一些化療抵抗的腫瘤[19]。

4.1p53介導(dǎo)的鐵死亡調(diào)控 p53是重要的抑癌基因，腫瘤細(xì)胞中突變頻率最高的基因，大約有50%以上的惡性腫瘤會發(fā)生p53的突變。p53的功能主要包括細(xì)胞周期阻滯，促進凋亡、衰老，調(diào)控細(xì)胞代謝，抑制細(xì)胞異常增殖[20]。野生型的p53主要被認(rèn)為能促進鐵死亡從而抑制腫瘤增殖，p53可以下調(diào)SystemXc-轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)水平來促進鐵死亡。但是腫瘤中p53往往發(fā)生突變，當(dāng)p53的K117，K161和K162發(fā)生突變時，p53會喪失對鐵死亡的促進[14]。

4.2鐵死亡誘導(dǎo)劑的抗腫瘤治療潛力 依據(jù)誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生的不同方式將藥物分成4種類型。第1類：降低GSH水平；第2類：直接抑制GPX4；第3類：降解GPX4和CoQ10；第4類：提高鐵水平誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化(表2)。

4.2.1第1類鐵死亡誘導(dǎo)劑 抑制腫瘤細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)會使它們更容易受到氧化損傷和細(xì)胞死亡，抗氧化的GSH被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的“阿喀琉斯之踵”。細(xì)胞內(nèi)GSH合成原料的胱氨酸來源主要有systemXc-和轉(zhuǎn)硫作用。而在部分腫瘤中，轉(zhuǎn)硫作用通路會因為突變或表觀修飾而失活，此時腫瘤細(xì)胞高度依賴于systemXc-來攝取胱氨酸，systemXc-的抑制劑可以發(fā)揮促進鐵死亡抑制腫瘤的作用[21]。在第一類鐵死亡誘導(dǎo)劑中，erastin在宮頸癌和卵巢癌中都有很好地抑制腫瘤的作用。另外2種erastin的衍生物piperazineerastin和imidazoleketoneerastin在纖維肉瘤和淋巴瘤模型中也有很好的作用[6,22]。FDA批準(zhǔn)的systemXc-的另一種抑制劑sulfasalazine本身是用于治療關(guān)節(jié)炎，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)也可以抑制淋巴瘤、胰腺癌和肺癌的增殖。另外一種老藥索拉非尼也被提出可以抑制systemXc-誘導(dǎo)鐵死亡。

4.2.2第2類與第3類鐵死亡誘導(dǎo)劑 在部分腫瘤中抑制systemXc-并不能發(fā)揮作用，可能因為這些腫瘤并不依賴systemXc-來合成GSH，或是在抑制systemXc-后腫瘤細(xì)胞有補償通路來提供抗氧化能力。此時直接靶向GPX4的第2類和第3類抑制劑成為更好的抑制腫瘤的策略[19]。RSL3是用的最多的GPX4抑制劑，在纖維肉瘤和眾多細(xì)胞模型中能顯著誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生[6]。WithaferinA可以抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖，altretamine可以抑制彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤和骨肉瘤增殖[23]。

4.2.3第4類鐵死亡誘導(dǎo)劑 相比于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞對鐵有更高的需求，被稱為腫瘤細(xì)胞的“鐵成癮”，這使腫瘤細(xì)胞更容易在提高鐵水平時發(fā)生鐵死亡。比如，腎癌中富含鐵的腫瘤微環(huán)境促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[21]。withaferinA除了可以抑制GPX4外，也能通過降解血紅素提高鐵的含量誘導(dǎo)鐵死亡，同樣FINO2能夠抑制GPX4和氧化三價鐵來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[23-24]。此外，一些搭載鐵的納米材料也能夠誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生鐵死亡[25]。

表2 鐵死亡誘導(dǎo)劑

5 總結(jié)與展望

鐵死亡是一種獨特的細(xì)胞死亡方式，它將細(xì)胞代謝中不同元素聚集在一起，包括鐵、硒、氨基酸、脂類和氧化還原穩(wěn)態(tài)。隨著鐵死亡研究的進展，開始認(rèn)識到其在廣泛的生物過程中起著重要作用，包括正常生理和多種病理情況下。許多證據(jù)表明，鐵死亡能夠抑制腫瘤增殖[1]。利用鐵死亡抑制增殖在針對化療抵抗的腫瘤中發(fā)揮了很好的效果。很多FDA批準(zhǔn)的小分子藥物包括阿替拉胺、索拉非尼和納米藥物在誘導(dǎo)鐵死亡抑制腫瘤方面表現(xiàn)出了良好的前景[26]。雖然對鐵死亡的研究越來越深入，但仍然存在幾點尚未清楚的地方值得繼續(xù)探究。第一，如何定義細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。目前常用的方法是通過電鏡直接觀察細(xì)胞的線粒體形態(tài)，以及利用質(zhì)譜和熒光探針檢測細(xì)胞是否發(fā)生脂質(zhì)過氧化。另一種方法是加鐵死亡抑制劑觀察細(xì)胞死亡是否減少，如果死亡減少則認(rèn)為發(fā)生的細(xì)胞死亡是鐵死亡。但是這2種方法都有明顯的不足，電鏡觀察和檢測脂質(zhì)過氧化都十分繁瑣并且難以普及，鐵死亡抑制劑則不夠直接，不完全令人信服，而且這2種方法無法在體內(nèi)檢測鐵死亡。如果能夠找到直接的鐵死亡標(biāo)志物，并且易于檢測，那么對于鐵死亡的研究進一步發(fā)展將是極大的提高。目前還在推進使用的方法是用探針檢測鐵的含量或者用抗體檢測一些能調(diào)控鐵死亡發(fā)生的重要節(jié)點蛋白，包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1和谷胱甘肽過氧化物酶4，以及脂質(zhì)過氧化釋放的小的脂肪族產(chǎn)物4-羥基烯醛等。第二，對鐵死亡深入機制的探究。找不到通用的廣為接受的鐵死亡標(biāo)志物，很大一部分是因為對鐵死亡機制的不完全了解。比如在進行到哪一步后鐵死亡將不可停止和逆轉(zhuǎn)，以及細(xì)胞最終死亡的機制等。鐵死亡機制的深入探究，將會對鐵死亡在臨床上的應(yīng)用發(fā)揮重要的作用。第三，在臨床前和臨床治療腫瘤環(huán)境中，鐵死亡誘導(dǎo)的特異性是什么？如何控制潛在的不良影響？腫瘤的基因突變能多大程度上影響鐵死亡的敏感性？腫瘤細(xì)胞的表觀修飾對調(diào)控鐵死亡有何作用？腫瘤免疫治療與鐵死亡是否能相互協(xié)同？納米材料在鐵死亡治療腫瘤中具體能發(fā)揮多大的作用等。

總之，鐵死亡領(lǐng)域仍有很多值得探索的方向，在臨床上的應(yīng)用也越來越重要。隨著更多現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和機制的深入探究，這種與凋亡、細(xì)胞程序性壞死和細(xì)胞自噬完全不同的死亡方式必將能與之共同出現(xiàn)在教科書上。