張 鑫，肖 妮

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院病理科，廣東 佛山 528000)

甲狀腺乳頭狀腺癌是常見(jiàn)的甲狀腺癌，惡性程度較低，但其發(fā)展緩慢，較為隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。甲狀腺乳頭狀腺癌發(fā)病機(jī)制尚不清楚，細(xì)胞的異常增生及細(xì)胞凋亡機(jī)制與甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。微小染色體維持蛋白7(minichro-mosome maintenance protein7，MCM7)是DNA復(fù)制的起始關(guān)鍵因子，調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞分裂[2]，而P27蛋白屬于細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑，具有負(fù)調(diào)控DNA復(fù)制的作用，兩者共同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，MCM7與P27異常表達(dá)均可導(dǎo)致細(xì)胞異常生長(zhǎng)[3]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族一員，能抑制細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞有絲分裂，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在正常組織中幾乎不表達(dá)，而在各種癌癥組織中過(guò)表達(dá)，在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4]。本研究分析了MCM7在不同甲狀腺組織之間、甲狀腺乳頭狀腺癌不同臨床特征之間的表達(dá)情況及其診斷價(jià)值，并分析了MCM7與survivin、P27的相關(guān)性，探討甲狀腺乳頭狀腺癌的可能機(jī)制，為其診斷治療提供理論支持。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 隨機(jī)選取我院2019年1月—2021年3月因甲狀腺疾病行外科手術(shù)切除的病理組織，其中甲狀腺乳頭狀腺癌60例，甲狀腺腺瘤40例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40例。另選取同期20例甲狀腺正常的死亡尸體解剖的甲狀腺組織。所有患者符合《甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》[5]中診斷標(biāo)準(zhǔn)。甲狀腺乳頭狀腺癌患者男性11例，女性49例，年齡18～68歲，平均(40.12±8.36)歲。甲狀腺腺瘤患者男性8例，女性32例，年齡19～66歲，平均(41.31±8.12)歲。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者男性9例，女性31例，年齡20～69歲，平均(42.52±7.85)歲。

本研究符合《赫爾辛基宣言》，所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2方法 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)甲狀腺組織中MCM7、survivin、P27的表達(dá)：組織樣本采用10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，采用石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica Biosystems公司，Leica RM2125 RTS)連續(xù)切片。采用SP檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，SP0041)對(duì)切片進(jìn)行染色，抗體使用兔抗人MCM7、survivin、P27一抗(美國(guó)abcam公司，ab52489、ab76424、ab32034)，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3觀察指標(biāo) 結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]：于高倍鏡(×400)下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野取200個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，MCM7、P27蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核，survivin陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色、褐色顆粒狀。根據(jù)著色強(qiáng)度(無(wú)色：0分、淡黃色：1分、棕黃色：2分、褐色或黑色：3分)、陽(yáng)性細(xì)胞比例(低于10%：1分、11%～50%之間：2分、51%～75%之間：3分、超過(guò)75%：4分)判斷陽(yáng)性表達(dá)情況，總分=著色強(qiáng)度得分×陽(yáng)性細(xì)胞比例得分，總分3分及以上為陽(yáng)性，3分以下為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；評(píng)估價(jià)值通過(guò)受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC曲線)評(píng)估，曲線下面積(area under curve，AUC)0.5～0.7時(shí)評(píng)估準(zhǔn)確性低，0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，>0.9準(zhǔn)確性較高。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同甲狀腺組織中MCM7、survivin、P27的表達(dá) 不同甲狀腺組織MCM7、survivin、P27表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀癌MCM7陽(yáng)性表達(dá)率為93.33%與甲狀腺腺瘤的27.50%、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的7.50%、正常甲狀腺的0.00%比較，明顯較高(P<0.05)。甲狀腺乳頭狀癌survivin陽(yáng)性表達(dá)率為96.67%與甲狀腺腺瘤的37.50%、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的15.00%、正常甲狀腺的0.00%比較，明顯較高(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀癌P27陽(yáng)性表達(dá)率為21.67%與甲狀腺腺瘤的100.00%、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的100.00%、正常甲狀腺的100.00%比較，明顯較低(P<0.05)。見(jiàn)表1～2，圖1。

表1 不同甲狀腺組織中MCM7的表達(dá)Table 1 The expression of MCM7 in different thyroid tissues (例數(shù)，%)

表2 不同甲狀腺組織中survivin、P27的表達(dá)Table 2 The expression of survivin and P27 in different thyroid tissues (例數(shù)，%)

圖1 甲狀腺乳頭狀癌組織MCM7、survivin、P27的免疫組織化學(xué)圖(SP ×400)

A.甲狀腺乳頭狀癌組織MCM7陽(yáng)性；B.甲狀腺乳頭狀癌組織survivin陽(yáng)性；C.甲狀腺乳頭狀癌組織P27陽(yáng)性

Figure 1 Immunohistochemical plot of MCM7, survivin, and P27 in papillary thyroid carcinoma tissues(SP ×400)

2.2甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7、survivin、P27陽(yáng)性表達(dá)單因素分析 不同性別、年齡的甲狀腺乳頭狀腺癌組織之間MCM7陽(yáng)性表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，腫瘤直徑>1 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的MCM7陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤直徑≤1 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ、淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移比較，明顯較高(P<0.05)；不同性別、年齡、腫瘤直徑的甲狀腺乳頭狀腺癌組織之間survivin陽(yáng)性表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的survivin陽(yáng)性表達(dá)率與TNM分期Ⅰ～Ⅱ、淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移比較，明顯較高(P<0.05)；不同性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀腺癌組織之間P27陽(yáng)性表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7、survivin、P27陽(yáng)性表達(dá)單因素分析Table 3 Univariate analysis of positive expression of MCM7, survivin and P27 in papillary thyroid adenocarcinoma tissue (例數(shù)，%)

2.3甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7與survivin、P27的相關(guān)性 甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7表達(dá)與survivin表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7表達(dá)與P27表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.4MCM7診斷甲狀腺乳頭狀腺癌ROC分析 MCM7診斷甲狀腺乳頭狀腺癌的AUC為0.942(95%CI：0.900～0.984，P<0.001)，診斷甲狀腺乳頭狀腺癌準(zhǔn)確性高。根據(jù)最佳臨界值，當(dāng)MCM7的cut-off值1.5時(shí)，約登指數(shù)為0.823，敏感度為93.3%，特異度為89.0%。見(jiàn)圖2。

表4 甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7與survivin、P27的相關(guān)性Table 4 Correlation of MCM7 with survivin and P27 in papillary thyroid adenocarcinoma (例數(shù))

圖1 MCM7診斷甲狀腺乳頭狀腺癌ROC曲線

3 討 論

甲狀腺癌是女性高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀腺癌占80%～90%，發(fā)病率近年來(lái)呈升高趨勢(shì)。目前臨床主要采用實(shí)驗(yàn)室檢查、超聲影像、細(xì)胞病理學(xué)進(jìn)行診斷，但診斷精準(zhǔn)仍有一定難度及技術(shù)水平，需大量臨床經(jīng)驗(yàn)[7]。因此，探討甲狀腺乳頭狀腺癌簡(jiǎn)單易行的病理分子診斷指標(biāo)具有重要價(jià)值。細(xì)胞周期異常引起的細(xì)胞過(guò)度增殖是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，而細(xì)胞凋亡被抑制導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡降低在腫瘤發(fā)展中起重要作用[8]。

細(xì)胞周期有四個(gè)時(shí)期，其中G1期為細(xì)胞分裂準(zhǔn)備期，主要合成DNA復(fù)制所需的核苷酸，S期為DNA合成期，主要合成DNA、組蛋白及相關(guān)酶，G2期主要合成RNA及細(xì)胞骨架所需蛋白質(zhì)[9]。DNA的復(fù)制、合成需要一個(gè)特定的復(fù)制起始點(diǎn)，G1早期MCM7與染色體上復(fù)制子結(jié)合參與形成復(fù)制前復(fù)合物，而在G1/S期MCM7被再活化，發(fā)揮DNA解鏈酶功能，最終啟動(dòng)DNA復(fù)制，延伸復(fù)制叉[10]。細(xì)胞周期中MCM7水平波動(dòng)變化，G0期表達(dá)下降，S期從染色質(zhì)上解離出來(lái)到達(dá)峰值，M期MCM7呈游離的微小染色體，而在細(xì)胞分化、凋亡時(shí)下降[11]。MCM7表達(dá)水平?jīng)Q定DNA復(fù)制能力，高M(jìn)CM7水平能提高DNA復(fù)制速度，增加細(xì)胞增殖速度、生長(zhǎng)能力。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀腺癌MCM7陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于其他組織，說(shuō)明甲狀腺乳頭狀腺癌存在明顯的細(xì)胞周期異常。腫瘤直徑>1 cm的患者M(jìn)CM7陽(yáng)性表達(dá)較高，提示MCM7過(guò)表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ的患者陽(yáng)性高表達(dá)，提示MCM7過(guò)表達(dá)促進(jìn)甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)展，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)CM7陽(yáng)性高表達(dá)，提示MCM7能促進(jìn)甲狀腺乳頭狀腺癌的浸潤(rùn)侵襲。

P27基因定位于12號(hào)染色體，屬抑癌基因，高度保守性，基因突變概率小，P27作為負(fù)性調(diào)控因子參與細(xì)胞周期調(diào)控，主要通過(guò)抑制CDK4和CDK2的磷酸化抑制cyclin-CDK活性，限制細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換[12]。本研究發(fā)現(xiàn)P27在甲狀腺乳頭狀腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯較少，而正常組織中幾乎均陽(yáng)性表達(dá)，提示可能因P27蛋白需在胞核中才發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能，甲狀腺乳頭狀腺癌細(xì)胞可能通過(guò)將胞核內(nèi)的P27蛋白泛素化降解減少或者向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移抑制其負(fù)調(diào)控活性[13]。Survivin基因定位于17號(hào)染色體，通常以二聚體的形式存在，屬于IAP家族，是一種細(xì)胞凋亡抑制蛋白，抑制活性明顯強(qiáng)于Bcl家族成員，可激活SMAC、p21、受體、線粒體/細(xì)胞色素C等通路，直接作用于caspase家族，抑制細(xì)胞凋亡。Survivin還可同時(shí)調(diào)控細(xì)胞周期，與CDK結(jié)合激活cyclin-CDK加快G1/S期轉(zhuǎn)換。Survivin正常生理下在G2/M期表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞分裂過(guò)程中紡錘體的形成，抑制caspase水解紡錘體，維持有絲分裂持續(xù)進(jìn)行，促進(jìn)了細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，余江濤等[14]通過(guò)沉默survivin基因能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀腺癌組織中survivin陽(yáng)性表達(dá)明顯高于其他組織，TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者陽(yáng)性表達(dá)明顯較高，提示survivin與甲狀腺乳頭狀腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，MCM7與P27呈顯著負(fù)相關(guān)，可能與P27基因的羧基末端結(jié)構(gòu)域能與MCM7的保守結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，抑制MCM7，負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期，確保細(xì)胞周期中DNA只復(fù)制一次，牛廣旭等[15]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中P27蛋白的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致MCM7的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞周期異常增生。本研究還發(fā)現(xiàn)MCM7與survivin顯著正相關(guān)，提示可能與survivin過(guò)表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡，使MCM7保持較高水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖，兩者可能共同促進(jìn)甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過(guò)ROC分析結(jié)果顯示，MCM7診斷的AUC為0.942，具有較高的診斷價(jià)值，可以作為診斷甲狀腺乳頭狀腺癌的病理分子標(biāo)志物。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀腺癌組織MCM7過(guò)表達(dá)，可能survivin過(guò)表達(dá)、P27蛋白低表達(dá)使MCM7保持高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，共同參與甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。MCM7可用于鑒別診斷甲狀腺乳頭狀腺癌，具有較高的準(zhǔn)確性，可以作為診斷甲狀腺乳頭狀腺癌的病理分子標(biāo)志物。本研究不足之處在于研究結(jié)論僅限于臨床理論基礎(chǔ)，還需后續(xù)進(jìn)一步細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。