宋 鵬，張 猛，姜淑娟，楊棟梁

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250000；2.山東省濟(jì)南市人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科， 山東 濟(jì)南 271100；3.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校公共課教學(xué)部，河北 滄州 061000)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎最常見的形式，其特征在于臨床癥狀為咳嗽和呼吸困難，氣體交換受限以及進(jìn)行性肺瘢痕形成[1]。目前己批準(zhǔn)2種用于治療IPF的有效藥物(尼達(dá)尼布和吡非尼酮)[2-3]。但是，由于藥物的可及性及療效的限制，大多數(shù)IPF患者最終死于呼吸衰竭。IPF的預(yù)后仍然充滿挑戰(zhàn)，因此需要更加全面地了解其疾病發(fā)病機(jī)制。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼RNA，可以通過與mRNA結(jié)合來抑制靶基因的表達(dá)[4]。 由于其在細(xì)胞凋亡、增殖和分化等細(xì)胞過程中的關(guān)鍵作用而引起了廣泛關(guān)注。在過去的十年中越來越多的研究尋找IPF潛在的生物標(biāo)志物，多種miRNA可以作為IPF預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)記，包括miR-92a、miR-210、miR-29、miR-326、miR-98 和miR-let-7d[5-7]。但是單個(gè)miRNA的研究不能滿足IPF快速發(fā)展的要求，構(gòu)建miRNA-mRNA聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)可能有助于探索適用于臨床的生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)的進(jìn)一步開發(fā)。本研究旨在通過基因表達(dá)綜合(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定miRNA表達(dá)譜中的差異表達(dá)miRNA(differentially expressed miRNAs，DEMis)和差異表達(dá)mRNA(differentially expressed mRNAs，DEMs)，以探索IPF的生物學(xué)過程。使用全面的生物信息學(xué)分析檢查DEMs和DEMis之間的相關(guān)性，并結(jié)合從DEMis和DEMs數(shù)據(jù)中檢索到的信息，通過GO及KEGG途徑富集分析篩選出IPF的潛在生物標(biāo)志物。

1 資 料 與 方 法

1.1數(shù)據(jù)集的獲取和分析 IPF相關(guān)miRNA和mRNA表達(dá)譜中的微陣列數(shù)據(jù)可從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlmNih.gov/geo)中檢索和下載。使用“idiopathic pulmonary fibrosis”作為關(guān)鍵字進(jìn)行查詢。搜索僅限于以下特定領(lǐng)域：研究類型，按陣列進(jìn)行的表達(dá)譜分析和種類(智人)。下載miRNA表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)集GSE27430和mRNA表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)集GSE135065。使用R studio中的limma軟件包獲得IPF患者與健康對(duì)照組之間差異表達(dá)的miRNA和mRNA。貝葉斯方法糾正批量效應(yīng)。如果有多個(gè)探針映射到同一基因中，則平均表達(dá)值被用來等于該基因的表達(dá)值。采用t檢驗(yàn)過濾差異表達(dá)的基因。DEMis和DEMs通過P<0.05和log FC>平均(logFC)+ 2×SD(logFC)進(jìn)行篩選。為了顯示DEMis和DEMs在不同樣品中的差異表達(dá)，通過在R studio中應(yīng)用圖和Pheatmap包繪制火山圖和熱圖。

1.2轉(zhuǎn)錄因子 靶標(biāo)的GO富集分析將DEMis上傳到FunRich(3.1.3)，這是用于對(duì)轉(zhuǎn)錄因子途徑的富集靶標(biāo)(基因/mRNA)進(jìn)行GO功能富集分析的常用工具。GO富集分析還用于開發(fā)miRNA、基因/mRNA和轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

1.3DEMis靶向mRNA的預(yù)測(cè) 使用miRDB(http://www.mirdb.org)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)和TargetScan(http://www.targetscan.org)數(shù)據(jù)庫(kù)來預(yù)測(cè)DEMis的靶向mRNA。之后，通過匹配之前選擇的DEMs進(jìn)一步過濾DEMis的預(yù)測(cè)mRNA，然后得到DEMis-DEMs的配對(duì)組合。

1.4miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上面選擇的所有DEMis-DEMs通過配對(duì)來構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)使用Cytoscape軟件(3.7.2版)對(duì)其進(jìn)行可視化。

1.5網(wǎng)絡(luò)中mRNA的GO和KEGG富集分析 在R Studio中使用了richplot和ggplot2軟件包對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行GO和KEGG途徑分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用R語(yǔ)言V3.6.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn),為了進(jìn)一步控制錯(cuò)誤率，使用了Benjamini和Hochberg方法來計(jì)算調(diào)整后的P值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1IPF中的DEMis篩選結(jié)果 根據(jù)前所述排除標(biāo)準(zhǔn)，miRNA的log FC的臨界值為1.5。確定了21個(gè)上調(diào)或下調(diào)的miRNAs，包括14個(gè)上調(diào)的miRNA以及7個(gè)下調(diào)的miRNA，見表1。通過log10(P值)和log(FC)相關(guān)性的火山圖直觀地說明了IPF和健康對(duì)照之間miRNA表達(dá)差異的分布(圖1)。并繪制熱圖以直觀顯示IPF和健康對(duì)照組之間的差異(圖2)。

圖1 DEMis的火山圖。紅點(diǎn):上調(diào)的基因；綠點(diǎn):下調(diào)的基因

圖2 DEMis的熱圖。左側(cè)12個(gè)樣品來自對(duì)照組，右側(cè)13個(gè)樣品來自IPF組;紅色：高表達(dá); 藍(lán)色：低表達(dá)

2.2差異miRNA的轉(zhuǎn)錄因子富集分析 32個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中總共映射748個(gè)基因。通過轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)的富集，篩選了與miRNA密切相關(guān)的前10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分別為特異性蛋白1(specific protein 1，SP1)、早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子1(early growth response 1，EGR1)、NK6同源框蛋白1重組蛋白(recombinant NK6 homeobox protein 1，NKX6-1)、結(jié)構(gòu)域 2 類轉(zhuǎn)錄因子 1(poudomain class 2 transcriptionfactor 1，POU2F1)、富含 AT 的交互式含域蛋白 3A(AT-rich interactive domain-containing protein 3，ARID3A)、心肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2A重組蛋白(recombinant myocyte specific enhancer factor 2A，MEF2A)、同源異型盒基因D8(homeobox gene D8，HOXD8)、同源異型盒基因A9(homeobox gene A9，HOXA9)、肝細(xì)胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4-alpha，HNF4A)、兔抗人受體相關(guān)孤兒受體α(rabbit anti-human retinoic acid receptor related orphan receptor A，RORA)(圖3)，表明這些轉(zhuǎn)錄因子與DEMis有調(diào)節(jié)關(guān)系。

表1 IPF樣本中21種差異表達(dá)的miRNA(DEMis)Table 1 21 differentially expressed miRNAs(DEMis) in IPF samples

2.3IPF中的DEMs篩選結(jié)果 本研究探討了9例IPF患者和9例健康對(duì)照的mRNA表達(dá)水平。 mRNA的log(FC)閾值為0.47；確認(rèn)了56個(gè)上調(diào)的mRNA和127個(gè)下調(diào)的mRNA。上調(diào)和下調(diào)的前20個(gè)基因(P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)見表2。火山圖和熱圖見圖4～5。

2.4在IPF中重建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò) 構(gòu)建了一個(gè)帶有3個(gè)mRNA和3個(gè)miRNA的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖6)，以進(jìn)一步展示DEMis和DEMs之間的相互作用，有助于理解miRNA在IPF中的作用。網(wǎng)絡(luò)中的度數(shù)、緊密度和中間度參數(shù)由Cytoscape軟件(版本3.7.2)中的cytoHubba插件計(jì)算。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示miR-338-3p、miR-199a-5p和miR-299-5p可能作為關(guān)鍵miRNA在IPF發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。跨膜6 超家族成員 1(transmembrane 6 superfamily member 1，TM6SF1)是miR-388-3p的靶標(biāo)mRNA；軸突生長(zhǎng)誘向因子G1(Netrin G1，NTNG1)是miR-199a-5p的靶標(biāo)mRNA；鈉通道電壓門控Ⅱ型α(sodium channel voltage-gated type Ⅱ alpha，SCN2A)是miR-299-5p靶標(biāo)mRNA。這3條途徑可能與IPF的發(fā)展有關(guān)。

圖3 DEMis的轉(zhuǎn)錄因子富集

圖4 DEMs的火山圖。紅色:上調(diào)的基因;綠點(diǎn):下調(diào)的基因

圖5 DEM的熱圖。紅色:高表達(dá);綠色:低表達(dá)

表2 前40個(gè)差異表達(dá)的mRNATable 2 The first 40 differentially expressed mRNAs

2.5調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中mRNA的功能富集分析 對(duì)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中mRNA的GO分析表明，CC terms在電壓門控鈉通道復(fù)合物、突觸膜的錨固成分、軸突旁節(jié)區(qū)、突觸前、突觸膜、谷氨酸能突觸、突觸膜的固有成分、突觸前膜、突觸前膜的固有成分、郎飛氏結(jié)等部位顯著富集。分子功能途徑包括細(xì)胞間黏附介體活性、鈉通道活性、電壓門控鈉通道活性及細(xì)胞內(nèi)黏附介體活性(圖7)，未做出BP途徑富集。mRNAs與富集途徑之間的關(guān)系見圖8。KEGG最重要的3條路徑(圖9)包括味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附分子及軸突導(dǎo)引。mRNA與KEGG富集途徑的關(guān)系見圖10。

圖6 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。紅色：上調(diào)的基因；綠色：下調(diào)的基因；mRNA用橢圓形表示，miRNA用三角形表示

圖7 IPF中DEMs富集的GO生物過程

圖8 mRNAs與富集途徑之間的關(guān)系

圖9 網(wǎng)絡(luò)中mRNA的KEGG途徑富集分析

圖10 KEGG中富集的mRNA之間的關(guān)系途徑

3 討 論

IPF是一種慢性纖維化性肺疾病，其特征是成纖維細(xì)胞的增殖和活化增加，包括成纖維細(xì)胞的積累、膠原蛋白的合成、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和糖蛋白的沉積。目前該病無法治愈，具有復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，已批準(zhǔn)吡非尼酮和尼達(dá)尼布用于減緩IPF的進(jìn)展。miRNA是一類非編碼的小RNA，其長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，是基因調(diào)控中的重要調(diào)控因子。先前的研究表明，肺纖維化的發(fā)病機(jī)制與多種因素有關(guān)，包括DEMis和miRNA控制的差異基因表達(dá)[8]。因此，篩選和鑒定在IPF中差異表達(dá)的miRNA和基因，以及研究DEMis和DEMs之間的相關(guān)性，有助于闡明IPF發(fā)病的分子機(jī)制，并為臨床新藥的靶點(diǎn)研發(fā)提供指導(dǎo)。

GEO是基于R編程語(yǔ)言的分析工具，用于研究DEMs。本研究分析來自IPF和正常組織樣品(GSE27430和GSE135065)的miRNA表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)，并鑒定了21種差異表達(dá)的miRNA。這些miRNA中有7個(gè)下調(diào)，14個(gè)上調(diào)。在21種已鑒定的DEMis和183種常見DEMs調(diào)控的前20條信號(hào)通路中，至少有3條與IPF的進(jìn)展有關(guān)，表明21個(gè)DEMis可能與IPF的進(jìn)展有關(guān)。為了更好地了解DEMis靶標(biāo)mRNA的機(jī)制，本研究篩選了可能的轉(zhuǎn)錄因子。其中SP1是最常見的轉(zhuǎn)錄因子，SP1參與調(diào)控與細(xì)胞外基質(zhì)生成和降解密切相關(guān)基因(MMP14、PAI等)的表達(dá)，而細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積是肺纖維化的重要特征[9]。第2個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄因子是EGR1，EGR1是肺纖維化常見的激活轉(zhuǎn)錄因子，可與SP1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MMP14啟動(dòng)子的GC序列，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)[10]。而NKX6-1、POU2F1、ARID3A、MEF2A、HOXD8、HOXA9、HNF4A、RORA等轉(zhuǎn)錄因子在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中亦有不同的作用。由此可見，參與IPF的轉(zhuǎn)錄因子及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常復(fù)雜，各種轉(zhuǎn)錄因子間會(huì)形成繁雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，參與調(diào)控IPF相關(guān)基因的表達(dá)。

在肺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，miRNA是約22個(gè)堿基的小型非編碼RNA，其可以通過靶向TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)事件，α平滑肌肌動(dòng)蛋白和膠原蛋白，Ⅰ型基因表達(dá)影響纖維化活性，由此引發(fā)各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑和生物進(jìn)展，包括Smad介導(dǎo)和非氨介導(dǎo)的途徑，分化、增殖、遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和細(xì)胞外基質(zhì)[11-12]。迄今為止，已在人類中鑒定出約2 000種miRNA。有研究顯示，在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中miR-199a-5p過度表達(dá)。然后在IPF患者的肺樣品中，也通過在成纖維細(xì)胞灶內(nèi)原位雜交，證實(shí)了其過表達(dá)[13]。表明miR-199a-5p可能與這種疾病的病理生理學(xué)有關(guān)，特別是在肺成纖維細(xì)胞的活化及其分化為成肌纖維細(xì)胞方面。實(shí)際上，miR-199a-5p在肺成纖維細(xì)胞中的過表達(dá)誘導(dǎo)了這些細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的增加，以及分化成肌纖維母細(xì)胞的能力。有研究分析了IPF肺中miRNA的表達(dá)，并通過定量RT-PCR驗(yàn)證了miR-299-5p的表達(dá)增加，并確定其在胚胎肺中類似地表達(dá)[14]。目前未檢索到miR-388-3p在IPF發(fā)展中的作用，值得進(jìn)一步探索。NTNG1和SCN2A是miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。NTNG1是一種軸突導(dǎo)向分子，包含層粘連蛋白型EGF樣結(jié)構(gòu)域，并通過GPI錨點(diǎn)與質(zhì)膜結(jié)合[15]。SCN2A基因位于染色體2q24.3，包含26個(gè)外顯子，編碼2 005個(gè)氨基酸。SCN2A基因編碼電壓門控鈉離子通道α2亞基，主要分布在興奮性神經(jīng)元軸突起始段、未髓鞘化軸突部位，在大腦中分布廣泛。到目前為止，與NTNG1相關(guān)的證據(jù)集中在精神和神經(jīng)疾病上，與SCN2A相關(guān)的證據(jù)多集中在兒童癲癇[16]，而兩者與IPF之間的關(guān)聯(lián)尚不清楚，是一個(gè)值得探索的新方向。

生物學(xué)過程和信號(hào)傳導(dǎo)途徑的富集分析表明，本研究中183個(gè)差異表達(dá)的基因與一系列生物學(xué)過程顯著相關(guān)，例如細(xì)胞黏附和生物學(xué)黏附。ECM受體相互作用和細(xì)胞黏附是DEGs豐富的重要途徑，已被證實(shí)與IPF的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[17-18]。這些發(fā)現(xiàn)表明，183個(gè)差異表達(dá)基因在IPF基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集中呈顯著差異表達(dá)，并且可能通過參與細(xì)胞黏附，生物黏附，ECM-受體相互作用等過程而參與IPF的進(jìn)展。

本研究有一些局限性。首先應(yīng)進(jìn)一步解釋IPF的潛在機(jī)制，并建立基因，miRNA，轉(zhuǎn)錄因子和mRNA組成的多重網(wǎng)絡(luò)。此外，由于缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，需要進(jìn)一步探索這些結(jié)論。