辛旭陽，鄒桂欣，趙玥，劉晶，尤獻民，馬躍海（遼寧省中醫(yī)藥研究院，沈陽 110034）

化胃舒顆粒由紅參、白術(shù)、茯苓、當歸、甘草、烏梅、半夏、陳皮、黃芪等藥材組成，具有降逆止嘔、益氣健脾等功效，用于緩解癌癥患者化療引起的食欲不振、惡心等不良反應(yīng)。紅參為處方中君藥，所含人參皂苷Rg、Re、Rb等人參皂苷有耐缺氧、抗疲勞、提高機體免疫功能等藥理作用，是與化胃舒顆粒質(zhì)量密切相關(guān)的一類化學(xué)成分。但研究中發(fā)現(xiàn)，在化胃舒顆粒中沒有檢測到人參皂苷Rg、Re、Rb等成分，分析有可能在提取過程中發(fā)生了降解。已有文獻資料報道，人參皂苷Rg、Re、Rb等成分易受溫度、pH 值等因素的影響而發(fā)生降解等化學(xué)反應(yīng)，在酸性條件下會降解成不同的次級苷，包括抗腫瘤活性較強的人參皂苷Rg、Rh等，其具有抑制腫瘤細胞的黏附、浸潤、增殖以及抗腫瘤新生血管形成作用，因此探討化胃舒顆粒中人參皂苷Rg、Re、Rb降解的原因及是否生成了具有活性的降解產(chǎn)物人參皂苷Rg和 Rh，對保證化胃舒顆粒的療效具有重要意義。

紅參中的人參皂苷成分與其他藥材配伍時，在提取、濃縮及干燥過程中會發(fā)生變化，化胃舒顆粒是由多種中藥藥材組成的復(fù)方制劑，包括當歸和酸性較強的烏梅等。前期研究結(jié)果提示，處方中黃芪、陳皮、玄參、甘草及烏梅等藥材會對化胃舒顆粒中人參皂苷Rg、Re、Rb含量有影響，本試驗通過比較紅參煎液、化胃舒全方液、紅參與烏梅共煎液及去除烏梅的全方共煎液等4種煎液中，人參皂苷Rg、Re、Rb、Rg、Rh的含量變化，以期為化胃舒顆粒中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分的測定及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；色譜工作站（Agilent Chemstation 工作站）；DAD 二極管陣列檢測器；FA1004 電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

人參皂苷Rg（批號：111730-201027），Re（批 號：110754-200822），Rb（批 號：110704-201122），Rh（批 號：111748-200501），Rg（批號：110804-200603）（供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）。紅參、白術(shù)、茯苓、當歸、甘草、烏梅、半夏、陳皮、黃芪（亳州市星躍藥業(yè)有限責任公司，符合《藥品經(jīng)營質(zhì)量管理規(guī)范》要求）。甲醇、乙腈為色譜純（安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?，水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1、Re及Rb1的含量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱 C（Synergiolar-Rp，250 mm×4.6 mm，4 μm），柱溫為30℃，流動相A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗 脫（0～10 min，0%～3%A；10～20 min，3%～10%A；20～25 min，10%～33%A；25～30 min，33%～50%A；30～35 min，50%～80%A；35～37 min，80%～83%A）；流速為1.0 mL·min；檢測波長為203 nm；進樣量為10～20 μL。人參皂苷對照品混合溶液及紅參供試品溶液典型HPLC圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）、紅參供試品溶液（B）的HPLC圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference substance（A）and red ginseng sample（B）

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg、Re及Rb對照品各適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每 1 mL各含Rg、Re、Rb為 2.047、1.855、2.589 mg的混合對照品儲備溶液，備用。

2.1.3 紅參水煎溶液的制備 取紅參藥材80 g（破碎），置2000 mL圓底燒瓶中，加入8倍量（6400 mL）水，加熱回流提取4 h，濾過，放冷后，備用。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密量取紅參水煎溶液適量，加水稀釋至100 mL，搖勻，置分液漏斗中，用水飽和正丁醇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗2次，每次50 mL，續(xù)用正丁醇飽和水洗1次，正丁醇液蒸干，殘渣用適量水溶解，上樣于預(yù)處理的D大孔吸附樹脂柱（20 cm×1.5 cm）上，用4 BV的蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，再用5 BV的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為紅參供試品溶液（折合紅參生藥量0.2 g·mL）。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取各溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定，以對照品進樣量（

X

）為橫坐標，相應(yīng)各峰面積（

Y

）為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程，結(jié)果

Y

＝252.3

X

＋2.510，

r

＝0.9994，線性范圍0.4094～10.24 μg；

Y

＝317.3

X

＋94.68，

r

＝0.9993，線性范圍0.3710～9.125 μg；

Y

＝421.1

X

＋125.6，

r

＝0.9995，線性范圍0.5178～12.95 μg，各成分在范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。2.1.6 精密度試驗 取紅參水煎溶液適量，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件平行進樣6次，測定人參皂苷Rg、Re和Rb峰面積，計算

RSD

分別為 1.2%、2.0%和1.1%，表明方法的精密度良好。2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.6”項下供試品溶液，分別于室溫放置 0、2、4、8、12、24 h時進樣，測定人參皂苷Rg、Re和Rb峰面積，計算

RSD

分別為 2.0%、1.8%、1.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.8 重復(fù)性試驗 精密量取紅參提取液適量，平行6份，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算人參皂苷Rg、Re和Rb含量分別為131.2、50.17、237.1 mg·g，

RSD

分別為1.0%、1.3%、1.9%，表明方法重復(fù)性良好。2.1.9 加樣回收試驗 精密量取紅參水煎溶液適量，平行6份，精密加入人參皂苷Rg、Re、Rb對照品溶液適量，再加水至約100 mL，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算人參皂苷Rg、Re、Rb回收率及

RSD

，結(jié)果見表1，表明方法的加樣回收率良好。

表1 人參皂苷Rg、Re和Rb加樣回收試驗
Tab 1 Recovery of ginsenosides Rg，Re and Rb

化合物 樣品中原含量/mg 檢出量/mg 加入量/mg 檢出總量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%人參皂苷Rg1 0.6629 0.6826 0.6987 1.3455 97.70 97.92 0.72 0.6629 0.6782 0.6987 1.3411 97.07 0.6629 0.6789 0.6987 1.3418 97.17 0.6629 0.6877 0.6987 1.3506 98.43 0.6629 0.6872 0.6987 1.3501 98.35 0.6629 0.6902 0.6987 1.3531 98.78人參皂苷Re 0.2535 0.2590 0.2683 0.5125 96.53 96.56 0.65 0.2535 0.2602 0.2683 0.5137 96.98 0.2535 0.2562 0.2683 0.5097 95.49 0.2535 0.2610 0.2683 0.5145 97.28 0.2535 0.2598 0.2683 0.5133 96.83 0.2535 0.2583 0.2683 0.5118 96.27人參皂苷Rb1 1.1980 1.1582 1.2108 2.3562 95.66 95.84 0.31 1.1980 1.1621 1.2108 2.3601 95.98 1.1980 1.1569 1.2108 2.3549 95.55 1.1980 1.1642 1.2108 2.3622 96.15 1.1980 1.1567 1.2108 2.3547 95.53 1.1980 1.1647 1.2108 2.3627 96.19

2.2 人參皂苷Rh2、Rg3含量測定方法

2.2.1 色譜條件 Kromail C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流 動 相A為 乙 腈，B為0.05% 磷酸水溶液，梯度洗脫（0～40 min，40%～60%A；40～50 min，60%～100%A），流速為1.0 mL·min，柱溫為30℃，檢測波長為203 nm，進樣量為20～50 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg及Rh對照品各適量，分別置5 mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，備用；分別精密量取上述各溶液2 mL，置同一5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL各含人參皂苷Rg、Rh為1.050 mg、1.194 mg 的混合對照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品液100 mL，用水飽和正丁醇提取6次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，搖勻，備用。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8及1.6 mL，分別置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取各溶液20 μL，進樣測定，以對照品進樣量（

X

）為橫坐標，相應(yīng)峰面積（

Y

）為縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程。結(jié)果

Y

＝1497

X

＋51.42，

r

＝0.9998，線性范圍為0.4200～6.72 μg；

Y

＝1957

X

＋22.21，

r

＝0.9999，線性范圍為0.478～7.642 μg。

2.3 化胃舒顆粒中紅參中苷類成分降解研究

2.3.1 研究思路 研究思路見圖2。

圖2 紅參中皂苷的降解研究思路Fig 2 Research ideas on the degradation of ginsenoside

2.3.2 樣品溶液的制備 紅參單煎液制備參見“2.1.3”項下方法。

① 全處方共煎液：按處方稱取相當于紅參80 g處方量的所有藥材適量，加入8倍量水，回流提取4 h，濾過，放冷后，取濾液，備用。

② 紅參配烏梅共煎液：取紅參80 g，烏梅片165 g，加水8倍量，回流提取4 h，濾過，放冷，取濾液，備用。

③ 去除烏梅外紅參與其他藥材共煎液：除烏梅藥材外，按處方取相當于紅參80 g處方量的其他藥材，加入8倍量水，回流提取4 h，濾過，放冷后，取濾液，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取“2.3.2”項下各溶液適量，置分液漏斗中，按“2.1.3”項下方法制備人參皂苷Rg、Re、Rb供試品溶液，按“2.2.3”項下方法制備人參皂苷Rg、Rh供試品溶液，濾過，備用。

2.3.4 測定方法與結(jié)果 分別吸取對照品、供試品溶液及加標樣品溶液20～50 μL，注入液相色譜儀中，分別按“2.1.1”及“2.2.1”項下色譜條件測定，計算相當于每100 g紅參藥材中人參皂苷Rg、Re、Rb及Rg、Rh含量，結(jié)果見表2，其典型HPLC色譜圖見圖3～4。

圖3 化胃舒顆粒中人參皂苷類成分的HPLC圖Fig 3 HPLC of ginsenosides in aqueous extract of Huaweishu A.人參皂苷Rg1、Re對照品（ginsenosides Rg1 and Re reference）；B.人參皂苷Rb1對照品（ginsenosides Rb1 reference）；C.全 處方共煎液（aqueous extract of Huaweishu）；D.紅參配烏梅共煎液（aqueous extract of red ginseng with smoked plum）；E.去除烏梅共煎液（Huaweishu without smoked plum）；1. 人參皂苷Rg1（ginsenosides Rg1）；2.人參皂苷Re（ginsenosides Re）；3.人參皂苷Rb1（ginsenosides Rb1）

從表2可知，紅參提取液中人參皂苷Rg、Re和Rb的含量分別為134.2、54.88和234.3 mg，而在化胃舒全處方提取液中人參皂苷Rg和Re沒有被檢測到，Rb的含量也下降約75%；紅參與烏梅共煎液中未檢測到人參皂苷Rg、Re和Rb；而在缺烏梅的化胃舒處方中可以檢出人參皂苷Rg、Re和Rb，只是含量有所降低。在4種煎提液中，經(jīng)加標樣品驗證，均未檢測到人參皂苷Rg和Rh。

表2 不同煎提液中人參皂苷的含量(mg)
Tab 2 Contents of ginsenoside in different extracts (mg)

煎提液 Rg1 Re Rb1 Rg3 Rh2紅參單煎液 134.2 54.88 234.3 － －全處方共煎液 － － 58.52 － －紅參與烏梅共煎液 － － － － －去除烏梅外紅參與其他藥材共煎液 40.58 41.29 120.8 － －

3 討論

3.1 檢測波長的確定

在2020年版《中國藥典》一部紅參飲片項下，人參皂苷Rg、Re、Rb的檢測波長為203 nm，沒有人參皂苷Rg及Rh的測定波長，在本試驗中曾對這5種待測成分的對照品溶液進行在線紫外掃描，結(jié)果均為末端吸收，結(jié)果5種成分的吸收曲線相似，因此參考人參皂苷Rg、Re、Rb檢測波長，將人參皂苷Rg及Rh的測定波長確定為203 nm。

圖4 人參皂苷Rg3對照品（A）、人參皂苷Rh2對照品（B）、全處方共煎液（C）的HPLC圖Fig 4 HPLC of ginsenosides Rg3（A），ginsenosides Rh2（B）and aqueous extract of Huaweishu（C）

3.2 烏梅對化胃舒中人參皂苷的影響

從表2可知，在化胃舒全處方共煎液中，人參皂苷Rg，Re沒有檢測到，人參皂苷Rb含量顯著降低，可能是由于這3種成分被降解。有文獻報道在特定的化學(xué)環(huán)境或生物環(huán)境下，常見人參皂苷的糖苷鍵可發(fā)生斷裂，降解為稀有人參皂苷Rh及Rg等。人參皂苷Rh屬于人參二醇型單糖皂苷，人參皂苷Rg屬于人參二醇型雙糖皂苷，在醋酸溶液酸性條件下，二醇組人參皂苷在提取過程中發(fā)生降解，可以獲得人參皂苷Rg，另外人參皂苷Rb發(fā)生水解可以轉(zhuǎn)化為20

R

和20

S

-人參皂苷Rg，Rb和Rg，二者呈現(xiàn)明顯的互為消長關(guān)系。烏梅中含有豐富的有機酸，其水煎液pH值在2.7左右，本研究中，紅參與烏梅配伍提取時，人參皂苷Rg、Re和Rb的含量均未檢出，提示處方中烏梅藥材所含酸性化合物可將人參皂苷水解，缺烏梅的化胃舒藥材配伍共煎液中可檢測到人參皂苷Rg、Re、Rb含量也證實了這一結(jié)果，在去除烏梅后，共煎液中人參皂苷Rg、Re和Rb都能檢出，只是含量有所降低，這也說明在化胃舒的處方中可能還存在其他成分，影響人參皂苷Rg、Re和Rb的含量。

3.3 人參皂苷Rg3、Rh2測定方法優(yōu)化及峰確認

由于人參皂苷Rg、Rh在紅參中的含量很低，復(fù)雜的處理過程會使其收率損失較大，因此供試品溶液制備中直接用正丁醇提取的方法，與其他雜質(zhì)成分的分離在色譜條件優(yōu)化中解決，試驗中對人參皂苷Rg、Rh進行了多種色譜條件試驗，并進行加標驗證及在線紫外光譜掃描以保證測定結(jié)果的準確性，結(jié)果表明在人參皂苷Rg與Rh保留時間附近有其他色譜峰，但都不是人參皂苷Rg與Rh。

3.4 小結(jié)

本文建立了化胃舒顆粒中紅參與不同藥材配伍共煎液中人參皂苷Rg、Re、Rb、Rg和Rh的HPLC色譜方法，測定了上述人參皂苷成分與化胃舒顆粒中不同藥材配伍時的含量，并對化胃舒顆粒中未檢出人參皂苷Rg、Re、Rb成分的原因進行了推測和驗證，提出烏梅藥材是降低人參皂苷Rg、Re、Rb含量的主要因素，處方中其他藥材也有一定的影響；初步推斷人參皂苷Rg、Re、Rb發(fā)生了降解，但并沒有降解為稀有人參皂苷Rg和Rh，由于人參皂苷水解的過程受多種因素影響，產(chǎn)物復(fù)雜，進一步的研究還在進行中。