劉加濤，孫小珊，宋帥，蘇涌，夏泉（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230032）

甲氨蝶呤（MTX）是一種抗葉酸藥物，通過(guò)抑制葉酸生物合成中的關(guān)鍵酶二氫葉酸還原酶發(fā)揮活性，廣泛用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤等疾病。MTX血藥濃度升高可能導(dǎo)致MTX毒性風(fēng)險(xiǎn)增加，包括腎毒性、中樞神經(jīng)毒性、皮膚毒性、胃腸道毒性、血液學(xué)毒性、肝毒性和肺毒性，充分水化和堿化尿液可以減少這些不良反應(yīng)的發(fā)生率。MTX不良反應(yīng)的發(fā)生頻率和嚴(yán)重程度與給藥途徑和血藥濃度有關(guān)，大多數(shù)毒性作用與血藥濃度有關(guān)，并且如果能早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行亞葉酸鈣解救治療通常是可逆的。MTX治療（尤其是高劑量時(shí)）的不良反應(yīng)發(fā)生率高，患者個(gè)體間的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)變化大，需要對(duì)MTX進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測(cè)，以指導(dǎo)亞葉酸類(lèi)似物的解救治療方案，降低MTX毒性反應(yīng)。

MTX的監(jiān)測(cè)方法有多種，早期的分析方法雖然靈敏度高，但是耗時(shí)耗力并要求使用放射性同位素；而使用抗體的生物分析方法，如放射免疫分析、熒光偏振免疫分析和酶放大免疫測(cè)定法，雖具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快和成本低等多種優(yōu)勢(shì)，但由于MTX與其代謝物之間潛在的抗體交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性降低。此外，采用串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）檢測(cè)MTX的方法雖具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，但質(zhì)譜相關(guān)設(shè)施昂貴，操作要求較高，醫(yī)院難以常規(guī)配備。因此，本研究旨在建立一種簡(jiǎn)單、快速、特異、靈敏的MTX血藥濃度測(cè)定的全自動(dòng)二維高效液相色譜（2D-LC）法，并在使用MTX治療的患者的常規(guī)藥物濃度監(jiān)測(cè)中進(jìn)行初步驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2D-LC-UV系統(tǒng)由FLC全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）及島津LC-20A液相色譜部件構(gòu)成，F(xiàn)LC連接第一維色譜泵、第二維色譜泵、檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器等色譜模塊；其中第一維色譜系統(tǒng)（LC1）完成樣品富集及一維分離，第二維色譜系統(tǒng)（LC2）完成進(jìn)一步分離檢測(cè)，兩維系統(tǒng)通過(guò)智能流路控制系統(tǒng)（TRS）連接，采用“中心切割”模式轉(zhuǎn)移目標(biāo)物，中間轉(zhuǎn)移柱同時(shí)承擔(dān)轉(zhuǎn)移、攔截雜質(zhì)的功能，工作站為L(zhǎng)ab Solution 工作站，具體結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。BT25S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；KDC-1044型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；渦旋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

圖1 全自動(dòng)二維液相色譜工作原理示意圖Fig 1 Schematic diagram of 2D-LC system

1.2 試藥

甲氨蝶呤對(duì)照品（批號(hào)：079K1241，Sigma公司，純度：99.9%）；甲醇、乙腈（色譜純，ACS）；磷酸、磷酸銨、三氟乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；ACP-1去蛋白劑、ACG保護(hù)劑（湖南德米特儀器有限公司），滅菌注射用水（四川科倫藥業(yè)有限公司），空白馬血清（批號(hào)：113I051，北京索萊寶科技有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

第一維色譜系統(tǒng)中，采用Aston SC2（C，4.6 mm×25 mm，5 μm）柱，流動(dòng)相為MVV-1D移動(dòng)相，流速0.6 mL·min；采用Aston SN中間柱（苯基柱，4.6 mm×10 mm，5 μm），流動(dòng)相為純水。第二維色譜系統(tǒng)中，采用Aston SX1柱（氰基柱，4.6 mm×75 mm，5 μm），流速1.0 mL·min，柱溫40℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)304 nm，等度洗脫，進(jìn)樣量400 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取甲氨蝶呤對(duì)照品4.54 mg置于2 mL量瓶中，加入適量色譜甲醇充分溶解并定容，配制成5.0 mmol·L的MTX儲(chǔ)備液，置于－80℃，備用。

2.3 質(zhì)控品溶液的配制

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2 mL，稀釋至1.0 mL，混勻，得1.0 mmol·L的MTX工作液。取1.0 mmol·L的MTX工 作 液0.2 mL，加入空白馬血清20 mL，混勻，得高濃度質(zhì)控品溶液（10.0 μmol·L）。依次配制中濃度（5.0 μmol·L），低濃度（0.10 μmol·L）質(zhì)控品溶液，于－20℃冰箱備用。

2.4 樣品處理

采集使用甲氨蝶呤治療的患者的靜脈血2 mL，以3000 r·min離心5 min。取血漿200 μL至1.5 mL EP管中，加入ACP-1去蛋白劑600 μL，渦旋混勻2 min，用高速冷凍離心機(jī)4℃下12 000 r·min離心10 min。取上清液，同樣條件下再次離心，取600 μL上清液至1.5 mL進(jìn)樣瓶中，再加入60 μL ACG保護(hù)劑，震蕩搖勻，即得。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系考察 取1.5 mL EP管若干，分別加入空白血清191.2 μL，然后加入系列濃度的甲氨蝶呤工作溶液各8.8 μL，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，即得12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05 μmol·L的血漿樣品，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。

2.5.2 回收率和精密度 平行制備0.1、5.0、10.0 μmol·L的低、中、高M(jìn)TX含藥血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算MTX濃度。均平行操作5次，計(jì)算回收率；且每個(gè)樣品均在24 h內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)

RSD

；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間

RSD

。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 平行制備濃度分別為0.1、5.0、10.0 μmol·L的MTX含藥血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行預(yù)處理，分別考察其室溫放置24 h、－20℃反復(fù)凍融3次和－20℃保存2周后MTX的穩(wěn)定性。

2.6 樣本

收集2019年10月28日—2020年12月17日某院接受甲氨蝶呤治療的24例患者的48份血樣，其中男性患者16例，女性患者8例，平均年齡是（24.4±23.8）歲（2～71歲），按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性及專(zhuān)屬性考察

分別取空白血漿、含MTX對(duì)照品血漿和患者血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理樣品，進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，MTX的出峰時(shí)間為7.24 min，并且在MTX出峰位置無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，專(zhuān)屬性較好，見(jiàn)圖2。

圖2 甲氨蝶呤二維液相色譜圖Fig 2 2D-LC chromatogram of methotrexate

3.2 線性關(guān)系考察

以甲氨蝶呤峰面積為

Y

，血漿濃度為

X

，通過(guò)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得甲氨蝶呤回歸方程為：

Y

＝7.416×10＋4.243×10（

r

＝0.9997），表明甲氨蝶呤在0.05～12.8 μmol·L與峰面積線性關(guān)系良好，最低定量限為0.05 μmol·L。

3.3 精密度試驗(yàn)

據(jù)“2.5.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)低、中、高3個(gè)濃度甲氨蝶呤的日內(nèi)精密度的

RSD

值分別為4.7%、1.6%和3.5%，均低于5.0%；日間精密度的

RSD

值分別為5.9%、2.2%和5.7%，均低于10.0%，表明儀器精密度良好。

3.4 回收試驗(yàn)

根據(jù)“2.5.2”項(xiàng)下方法測(cè)定得到0.1、5.0和10.0 μmol·L樣品的回收率分別為（94.61±5.6）%、（99.17±1.7）%和（103.99±3.5）%，

RSD

均小于10.0%，表明該方法的回收率較高，符合生物樣品分析要求。

3.5 穩(wěn)定性考察

根據(jù)“2.5.3”項(xiàng)下方法考察穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤在室溫、－20℃反復(fù)凍融和長(zhǎng)期凍存后濃度的

RSD

值分別在0.40%～5.9%、0.35%～2.0%和1.2%～2.2%，各濃度組的

RSD

均小于6.0%，表明甲氨蝶呤在上述條件下穩(wěn)定。

3.6 甲氨蝶呤血藥濃度測(cè)定

對(duì)24例患者使用MTX治療的患者的48份樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)72.9%（35/48）的MTX樣本藥物濃度均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，另有16.7%（8/48）的樣本因患者使用大劑量MTX后0或24 h 濃度超出正常值上限，0 h濃度最高可達(dá)到600.26 μmol·L（392.3～600.26 μmol·L），24 h MTX血濃度最高可達(dá)到73.34 μmol·L（1.33～73.34 μmol·L）。此外，本研究中有10.4%（5/48）的樣本因患者使用低劑量治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎而未檢出MTX。隨著時(shí)間推移，患者血漿MTX濃度顯著下降，用藥后48 h后83.3%（15/18）的患者M(jìn)TX濃度低于1.0 μmol·L，用藥72 h后約88.89%（16/18）的患者M(jìn)TX濃度低于0.1 μmol·L。

4 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，基于藥代動(dòng)力學(xué)指導(dǎo)下的亞葉酸鈣治療是解救危及生命的MTX相關(guān)毒性的關(guān)鍵。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，如果延遲給予亞葉酸鈣將達(dá)不到解救治療的效果，而高劑量的MTX需要不成比例的亞葉酸鈣解救，這表明亞葉酸鈣的解救時(shí)間和劑量必須以監(jiān)測(cè)MTX水平為基礎(chǔ)。MTX治療后接受解救治療的最佳時(shí)機(jī)尚不清楚，最初研究提示血清水平低于0.05 μmol·L之前均需要給予支持治療。研究表明，在MTX用藥后42～48 h，血藥濃度在0.20～0.90 μmol·L范圍內(nèi)可停止亞葉酸鈣解救治療，而72 h時(shí)的 MTX濃度應(yīng)低至0.10 μmol·L。另有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于腎功能正常的患者，當(dāng)MTX水平為0.1 μmol·L時(shí)，可以停用甲酰四氫葉酸。為安全起見(jiàn)，本研究納入的患者均采用0.1 μmol·L作為解救治療的閾值，并發(fā)現(xiàn)約88.89%（16/18）的患者在用藥結(jié)束后72 h血漿MTX濃度低于0.1 μmol·L，所有患者均未發(fā)生嚴(yán)重的毒副作用。

本研究建立測(cè)定MTX濃度的2D-LC法，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)，最低定量限可達(dá)到0.05 μmol·L，不僅可以滿足大劑量MTX化療后亞葉酸鈣解救的需要，而且可用于部分使用MTX治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及小兒白血病患者的MTX血藥濃度監(jiān)測(cè)，可更好地為臨床醫(yī)師提供安全用藥參考。

2D-LC是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型液相色譜技術(shù)，已經(jīng)成為藥物分析中的重要手段之一。2D-LC是由兩種不同分離機(jī)制的色譜技術(shù)提供的不同保留機(jī)制的組合，顯著提高了分析的敏感性。本研究使用的2D-LC采用自動(dòng)中間柱作為轉(zhuǎn)移接口，不僅具有捕獲和傳遞的功能，而且還具有攔截的功能，使分析物從共洗脫混合物中分離出來(lái)。與其他液相色譜系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有樣品前處理簡(jiǎn)單，色譜柱平衡時(shí)間短（通常10 min平衡完畢），測(cè)定完成后色譜柱無(wú)需清洗以及流動(dòng)相可以長(zhǎng)期放置（商業(yè)化試劑已事先滅菌和密封）等諸多優(yōu)點(diǎn)。這些技術(shù)大大節(jié)省了治療藥物監(jiān)測(cè)工作中的儀器準(zhǔn)備和維護(hù)時(shí)間，增加了血藥濃度檢測(cè)的時(shí)效性。此外，本試驗(yàn)中采用特異性的ACP-1去蛋白沉淀劑，可有效去除雜質(zhì)成分，加入的保護(hù)劑不僅可穩(wěn)定藥物，還可對(duì)色譜柱起到保護(hù)作用。

總之，本文所建立的方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，能滿足臨床報(bào)告及時(shí)性、準(zhǔn)確性等要求，有助于醫(yī)師根據(jù)患者的MTX血藥濃度預(yù)先判斷不良反應(yīng)并及時(shí)對(duì)治療進(jìn)行調(diào)整，保證患者用藥安全有效，提高個(gè)體化用藥水平。