鄭有德，陳小紅，莫太剛，2，，樊三虎，2，，駱學(xué)慶，孟倫秀，張定堃（. 成都三勒漿藥業(yè)集團四川華美制藥有限公司，成都 60045；2. 乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室，成都 6002；. 成都三勒漿藥業(yè)集團-成都中醫(yī)藥大學(xué)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合實驗室，成都 60045）

柯里拉京（corilagin，分子式：CHO），又稱柯子次鞣素、訶里拉京，屬天然植物多酚單寧酸類化合物，為類白色固體粉末，可溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜等有機溶劑?？吕锢┦且环N可以從許多植物提取的水溶性逆沒食子酸鞣質(zhì)，如蜜柑草屬植物、牦牛兒苗屬植物、老鸛草屬植物、大戟屬植物、鐵莧屬植物、安石榴屬植物、槭屬植物及欖仁樹屬植物等?？吕锢槿~下珠、老鸛草、蜜柑草、白三草等植物的有效成分，也存在于余甘子、龍眼、橄欖、訶子中等。研究表明柯里拉京具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗纖溶、降血壓、抑制病毒、抗菌、抗炎等。

本文以葉下珠全草為研究對象制備高純度柯里拉京對照品，現(xiàn)報道如下。

1 材料

大戟科油柑屬植物葉下珠（

Phyllanthus urinaria

L.）干燥全草購于成都五塊石藥材市場，產(chǎn)地四川廣元，經(jīng)吳燕成總工程師確認。95%乙醇（批號：20021018）、鹽酸（批號：20020816）（分析純，成都光華化學(xué)試劑廠），乙腈（分析純，上海陸都實業(yè)有限公司，批號：20021028），丙酮（分析純，重慶東試化工有限公司，批號：20021116），D101大孔樹脂（天津南開大學(xué)精細化學(xué)試驗廠，批號20021206），Sephadex LH-20（瑞典，批號：292931），Diaion HP-20（日本三菱化學(xué)公司，批號：2H508），硅膠GF254（化學(xué)純，國家藥典委員會監(jiān)制青島海洋化工集團公司，批號：9639）；紫外燈、Water 2996高壓液相色譜儀（Waters）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取分離與純化

① 稱取葉下珠干燥全草300 g，鍘成3～5 cm的段，加入20倍以上純水浸泡0.5 h，分別微沸煎煮1.5、1 h，濾過，合并兩次濾液，減壓濃縮至約1.2 kg，離心除去沉淀。② 濃縮液通過D101大孔吸附樹脂，用至少20 L純化水洗滌，檢測后棄去水液。用70%乙醇洗脫至無柯里拉京檢出，洗脫液減壓濃縮，置入蒸發(fā)皿中揮去殘留乙醇，得濃縮液200～400 mL。③ 濃縮液放冷，濾過，濾液通過Diaion HP-20 大孔吸附樹脂，用10 L以上純化水洗滌，檢測后棄去水溶液。用70%乙醇洗脫，至無柯里拉京洗出，洗脫液減壓濃縮，入蒸發(fā)皿中揮去殘留乙醇，濃縮液放冷加入7倍乙腈攪拌均勻，沉淀0.5 h，濾除沉淀，濾液減壓濃縮回收乙腈，再入蒸發(fā)皿中揮去殘留乙腈，得濃縮液約100 mL。④ 濃縮液放至室溫，小心置Sephadex LH-20柱上端，用約10 L蒸餾水洗滌，檢測后棄去洗滌液。用20%丙酮液洗脫，至無柯里拉京檢出，洗脫液減壓濃縮，入蒸發(fā)皿中揮去殘留丙酮至有較多晶體析出，冷至室溫，充分冷藏，抽濾出結(jié)晶。⑤ 柯里拉京粗結(jié)晶，用50%～60%乙腈反復(fù)重結(jié)晶至得到近白色結(jié)晶。結(jié)晶揮去溶劑后放入五氧化二磷干燥器干燥至恒重，得柯里拉京2.4 g，平均收率約0.8%。

2.2 純度分析

2.2.1 薄層色譜 取柯里拉京，加甲醇制成每mL含5 mg的溶液，照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部附錄）試驗，取此溶液4、8、12、16、20 μL，點于硅膠GF薄層板或十八烷基鍵合硅膠（PR-18 FS）薄層板上，分別以乙腈-10%醋酸（9∶1）或乙腈-HO（2∶8）為展開劑，展開，取出，晾干，于紫外光（365 nm）下觀察，或噴以1%FeCl-乙醇溶液，結(jié)果薄層板顯單一色斑，除主斑點外均未見雜質(zhì)斑點。

2.2.2 純度測定色譜柱：Lunar C（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸（20∶80），檢測波長：220 nm、254 nm、272 nm、330 nm；柱溫：30℃，進樣量：10 μL。結(jié)果均未見明顯雜質(zhì)峰。

2.2.3 含量測定 照高效液相色譜法（《中國藥典》2020年版四部）測定。Water 2996型高效液相色譜儀及Water 2996可變波長檢測器，Empower工作站，手動進樣器，C色譜柱（Lunar，Phenomenex，150 mm×4.6 mm，5 μm），溶劑均為色譜純，試劑均為分析純。色譜條件為流動相：乙腈-0.5%醋酸（1∶9），檢測波長：272 nm，流速：1 mL·min，柱溫：25℃。取柯里拉京約0.8 mg，各3份，精密稱定，加水溶解并稀釋至10 mL，搖勻，即得。測得柯里拉京峰面積分別為2756 356、2724 593、2745 250，

RSD

為0.59%，按歸一法計算含量100%。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

mp 210℃（分解）；：－245（C，1.5，EtOH）；IR（KBr）cm：3416（羥基），1715，1695（羰基），1616，1532（苯環(huán)）等；MS（FAB）[M-H]＝633；MS（ESI）[M-H]＝633.07；H-NMR（400 MHz，MeOD）

δ

：7.08（2H，s，Galloy，A，H-2，6），6.72（1H，s，HHDP，B，H-2），6.69（1H，s，HHDP，C，H-2），6.39（1H，d，

J

＝4.0 Hz，Glucose-H-1），4.96～5.02（2H，m），4.55～4.57（1H，m），4.49（1H，d，

J

＝4 Hz），4.17～4.21（1H，m），4.01～4.03（1H，m）；C-NMR（100 MHz，MeOD）

δ

：95.0（glc-C-1），71.5（glc-C-2），76.1（glc-C-3），65.0（glc-C-4），76.1（glc-C-5），62.4（glc-C-6），120.5（Gal-C-1），110.9（Gal-C-2，6），146.3（Gal-C-3，5），140.4（Gal-C-4），166.6（Gal-C-7），125.4（HHDP，B，C-1），125.5（HHDP，C，C-1'），108.3（HHDP，B，C-2），110.1（HHDP，C，C-2），143.5（HHDP，B，C-3），143.8（HHDP，C，C-3'），135.1（HHDP，B，C-4；C，C-4'），144.3（HHDP，B，C-5；C，C-5'），115.0（HHDP，B，C-6），115.3（HHDP，C，C-6'），168.5（HHDP，B，C-7），170.1（HHDP，B，C-7'）?？吕锢榘咨Y(jié)晶狀固體，mp 210℃（分解），： －245（C，1.5，EtOH），其溶液遇三氯化鐵呈深蘭色，紫外吸收光譜

λ

（MeOH）219 nm、272 nm；IR（KBr）cm：提示有羥基（3417），羰基（1715，1695），苯環(huán)（3077，1616，1532）；MS（FAB）示M＝633（M-1），結(jié)合H-NMR、C-NMR及DEPT譜，推定其分子式為CHO，分子不飽和度為17。重水交換試驗提示具有11個羥基，其中9個在H-NMR譜中出現(xiàn)在

δ

8.16～9.34的低場位置，提示為酚羥基。根據(jù)C-NMR中的

δ

92.2及其余

δ

62.2～77.7等5個碳的化學(xué)位移，可判斷分子中具有吡喃葡萄糖的結(jié)構(gòu)部分；根據(jù)在H-NMR及H-H-COSY譜

δ

7.03（2H，s）、6.56（1H，s）及6.49（1H，s）出現(xiàn)4個不相關(guān)的芳質(zhì)子信號，可以判斷該化合物分子中有沒食子?；╣alloyl）及HHDP（六羥基苯甲?；┗鶊F的取代。由于H-NMR中除糖H-1及糖H-2的偶合常數(shù)

J

外，其余糖上連位質(zhì)子2，3，4，5間的偶合常數(shù)均較小這一特點，表明糖為C構(gòu)象為船式構(gòu)象，提示HHDP取代于糖的C-2及C-4或C-3及C-6位。H-C 化學(xué)位移相關(guān)試驗結(jié)果可見：糖H-1質(zhì)子（

δ

6.20）與

δ

164.8的酯羰基相關(guān)，后者又與沒食子?；]食子酰，A）上的芳質(zhì)子（

δ

7.03）相關(guān)，證明沒食子?；〈谔荂-1位；同樣，糖H-3質(zhì)子（

δ

4.59）與

δ

166.8的酯羰基相關(guān)，后者又與HHDP（B）上的芳質(zhì)子（

δ

6.58）相關(guān)；糖H-6質(zhì)子（

δ

4.24）與

δ

167.1的酯羰基相關(guān)，后者又與HHDP（C）上的芳質(zhì)子（

δ

6.52）相關(guān)，證明HHDP基取代于糖的C-3及C-6位。

根據(jù)以上理化常數(shù)及光譜數(shù)據(jù)，可確定本化合物為鞣質(zhì)類化合物柯里拉京（結(jié)構(gòu)式見圖1）。

圖1 柯里拉京的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of corilagin

3 小結(jié)

葉下珠是提取柯里拉京較好的原料，分離難度小，收率穩(wěn)定。文獻報道陜西、四川、廣西產(chǎn)的葉下珠中柯里拉京含量最高。本研究在純化的同時也對訶子、余甘子藥材中柯里拉京的成分進行了初步研究，結(jié)果提示以訶子提取物噴干粉及訶子提取液制備柯里拉京時發(fā)現(xiàn)其對葡聚糖凝膠污染較大，且分離難度大故而收率較低。余甘子及余甘子汁也尚難以作為提取柯里拉京的原料。

葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）是鞣質(zhì)分離常用的樹脂，其缺點是對某些鞣質(zhì)吸附太強而不易洗脫，從而影響凝膠壽命。精制純化過程中分別選用乙醇、甲醇和乙酸、丙酮作為洗脫劑，發(fā)現(xiàn)20%丙酮作為洗脫劑時效果較好。此外，當重結(jié)晶溶劑乙腈濃度為80%時會使母液濃縮后析出結(jié)晶過快，經(jīng)摸索發(fā)現(xiàn)50%～60%乙腈較適宜。

致謝：

四川省中藥所羅澤淵、周德慶、羅學(xué)成；四川華美制藥有限公司總工程師吳燕成。本研究中結(jié)構(gòu)鑒定由中國食品藥品檢定研究院分部等單位協(xié)助完成。